মিরনা -9 এর এপিজেনেটিক সাইলেন্সিং হিঙ্ক 1 অনকোজেনিক ক্রিয়াকলাপ এবং মেডুলোব্লাস্টোমার দুর্বল প্রাগনোসিসের সাথে সম্পর্কিত | ক্যান্সারের ব্রিটিশ জার্নাল

মিরনা -9 এর এপিজেনেটিক সাইলেন্সিং হিঙ্ক 1 অনকোজেনিক ক্রিয়াকলাপ এবং মেডুলোব্লাস্টোমার দুর্বল প্রাগনোসিসের সাথে সম্পর্কিত | ক্যান্সারের ব্রিটিশ জার্নাল

Anonim

বিষয়

  • ক্যান্সার এপিগনেটিক্স
  • সিএনএস ক্যান্সার
  • miRNAs
  • পূর্বাভাস

এই নিবন্ধটি আপডেট করা হয়েছে

বিমূর্ত

পটভূমি:

মাইক্রোআরএনএ -9 হ'ল নিউরোনাল বিকাশের একটি মূল নিয়ামক যা মেডুলোব্লাস্টোমা সহ মস্তিষ্কের ত্রুটিগুলিতে কমই প্রকাশিত হয়। মাইক্রোআরএনএ -9 মেডেলোব্লাস্টোমা প্যাথোজেনেসিসে অবদান রাখার প্রক্রিয়াগুলি অস্পষ্ট থেকে যায় এবং এই প্রক্রিয়াটি নিয়ন্ত্রণ করে এমন উপাদানগুলি বর্ণিত হয়নি।

পদ্ধতি:

মেডুলোব্লাস্টোমা সেল লাইনগুলিতে এবং প্রাথমিক নমুনাগুলিতে মাইক্রোআরএনএ -9 এর অভিব্যক্তি এবং মিথিলিকেশন স্থিতি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। মাইক্রোআরএনএ -9 এক্সপ্রেশনটির মেডিলোব্লাস্টোমা রোগীদের ক্লিনিকাল ফলাফলের সাথে সংযুক্তি নির্ণয় করা হয়েছিল এবং মাইক্রোআরএনএ -9 পুনরুদ্ধারের প্রভাবটি মেডুলোব্লাস্টোমা কোষগুলিতে কার্যত বৈধতা পেয়েছিল।

ফলাফল:

মাইক্রোআরএনএ -9 এক্সপ্রেশনটি সাধারণ ভ্রূণের সেরিবেলামের সাথে তুলনায় এমবি নমুনার একটি বৃহত উপসেটে দমন করা হয়। কম মাইক্রোআরএনএ -9 এক্সপ্রেশনটি প্রতিকূল হিস্টোপ্যাথোলজিকাল বৈকল্পিক নির্ণয়ের সাথে এবং খারাপ ক্লিনিকাল ফলাফলের সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে সংযুক্ত lates মাইক্রোআরএনএ -9 নীরবতা ক্যান্সার-নির্দিষ্ট সিপিজি দ্বীপের হাইপারমেথিলিকেশনের মাধ্যমে ঘটে। এইচইএস 1 টি মাইদুওলব্লাস্টোমাতে মাইক্রোআরএনএ -9 এর সরাসরি টার্গেট হিসাবে চিহ্নিত হয়েছিল এবং মাইক্রোআরএনএ -9 পুনরুদ্ধার কোষ চক্রের গ্রেফতার, ক্লোনাল বৃদ্ধি রোধ করতে এবং মেডুলোব্লাস্টোমা কোষের পার্থক্য প্রচার করার জন্য প্রদর্শিত হয়েছিল।

উপসংহার:

মাইক্রোআরএনএ -9 হ'ল একটি মেথিলেশন-সাইলেন্সড টিউমার দমনকারী যা মেডুলোব্লাস্টোমাতে খারাপ রোগ নির্ধারণের জন্য সম্ভাব্য প্রার্থী ভবিষ্যদ্বাণীমূলক চিহ্নিতকারী হতে পারে। মাইক্রোআরএনএ -9 এর ক্ষতি টিউমার কোষগুলিকে একটি প্রসারিত সুবিধা দিতে পারে এবং এটি সম্ভবত রোগের প্যাথোজেনেসিসে অবদান রাখতে পারে। সুতরাং, মাইক্রোআরএনএ -9 এর পুনঃপ্রকাশটি মেডুলোব্লাস্টোমার বিরুদ্ধে একটি উপন্যাসের এপিগনেটিক নিয়ন্ত্রণের কৌশল গঠন করতে পারে।

প্রধান

শিশুদের মধ্যে সবচেয়ে সাধারণ ম্যালিগন্যান্ট ব্রেন টিউমার হ'ল মেডুলোব্লাস্টোমা (এমবি)। সাম্প্রতিক চিকিত্সা অগ্রগতি সত্ত্বেও, এমবি আক্রান্ত প্রায় 30% শিশু তাদের রোগে মারা যাবে (নর্থকোট এট আল, 2012 এ)। যারা বেঁচে থাকেন তাদের থেরাপি সম্পর্কিত সিক্লেইয়ের ফলস্বরূপ প্রায়ই জীবনযাত্রার একটি উল্লেখযোগ্য পরিমাণ হ্রাস পায় (মুলার্ন এট আল, 2005)। এইভাবে মৃত্যুর হার এবং অসুস্থতা হ্রাস করার জন্য উপন্যাস এবং লক্ষ্যযুক্ত চিকিত্সার কৌশল প্রয়োজন। সম্প্রতি, মলিকুলার প্রোফাইলিং স্টাডিজ বিভিন্ন জিনের অভিব্যক্তির উপর ভিত্তি করে নির্দিষ্ট থেরাপির জন্য সম্ভাব্য লক্ষ্যগুলি সহ এমবি টিউমারগুলির চারটি মূল উপগোষ্ঠী সনাক্ত করেছে (কুল এট আল, ২০০৮; নর্থকোট এট আল, ২০১১)। ডাব্লুএনটি টিউমারগুলি সক্রিয় উইংলেস পাথওয়ে দ্বারা চিহ্নিত করা হয় এবং বর্তমান চিকিত্সা ব্যবস্থাগুলির অধীনে অনুকূল প্রাগনোসিস বহন করে। এসএইচ টিউমারগুলি সক্রিয় হেজহোগ সংকেত রাখে এবং একটি অন্তর্বর্তী পূর্বনির্ধারণ থাকে। গ্রুপ 3, উচ্চ এমওয়াইসি স্তরের দ্বারা চিহ্নিত এবং গ্রুপ 4 টি টিউমারগুলি আণবিকভাবে কম ভাল বৈশিষ্ট্যযুক্ত, সাধারণত দুর্বল প্রাগনোসিসের সাথে সম্পর্কিত হয় (টেলর এট আল, 2012)। আণবিক-ভিত্তিক উপ-গোষ্ঠীকরণের ফলে এমবি-র বিরুদ্ধে লড়াইয়ে দুর্দান্ত অগ্রসর হওয়া সত্ত্বেও, প্রয়োজনীয় জৈবিক পরিবর্তনগুলি সনাক্ত করার জন্য অতিরিক্ত প্রচেষ্টা করা প্রয়োজন যা তৈরি করা থেরাপিগুলি দ্বারা লক্ষ্যবস্তু হতে পারে।

মাইক্রোআরএনএ (এমআইআরএনএ) হ'ল ছোট আরএনএ অণু যা এমবি (হুমেল এট আল, ২০১১; ডাবুক এট আল, ২০১২) সহ সাধারণ মানব মস্তিষ্ক এবং মস্তিষ্কের উভয় টিউমার বিকাশের সময় মূল নিয়ামক হিসাবে আবির্ভূত হয়েছিল। 3 ′ ইউটিআরের সাথে আবদ্ধ হওয়ার পরে, এমআরএনএগুলি অনুবাদকে অবরুদ্ধ করে এবং / অথবা এমআরএনএ অবক্ষয়কে প্ররোচিত করে লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তিটিকে নিম্নগামী করে। সম্প্রতি, নির্দিষ্ট এমআরএনএ অভিব্যক্তি স্বাক্ষরগুলি মস্তিষ্কের টিউমারগুলির আণবিক শ্রেণিবিন্যাস উন্নত করতে সহায়তা করে এবং থেরাপির প্রতিক্রিয়া এবং প্রাগনোসিসের নির্ণয় এবং ভবিষ্যদ্বাণীকে সহজতর করেছে (ফার্নান্দেজ এট আল, ২০০৯)। এমআরএনএগুলিকে এমবি টিউমার প্যাথোজেনেসিসে একটি গুরুতর সংখ্যক এমবি প্রাথমিক নমুনা (পাং এট আল, ২০০৯; টার্নার এট আল, ২০১০) পর্যবেক্ষণের কারণে তাদের এমবি টিউমার প্যাথোজেনেসিসে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা রাখার পরামর্শ দেওয়া হয়। নিউআরোনাল টিস্যুতে প্রকাশিত বা টিউমার বিকাশের সাথে জড়িত এমআইআরএনএগুলির একটি হাই থ্রুপুট এক্সপ্রেশন প্রোফাইল মানব প্রাথমিক এমবি নমুনায় মাইক্রোআরএনএর প্রকাশের একটি টিউমার-নির্দিষ্ট প্যাটার্ন প্রকাশ করেছে (ফেরেটি এট আল, ২০০৯)। বিশেষত, এমআইআর -9 সাধারণ ভ্রূণের সেরিবেলামের তুলনায় এমবি টিউমারগুলির নিম্ন স্তরে প্রকাশিত একটি মূল মাইআরএনএগুলির মধ্যে একটি হিসাবে দেখা গেছে।

এমআইআর -9 হ'ল নিউরোজেনসিসের সময় নিউরোনাল প্রজনেট সেল ভাগ্য নিয়ন্ত্রক (উইনহোল্ডস এট আল, ২০০;; শিবাটা এট আল, ২০১১), যা সম্প্রতি ক্যান্সারে জড়িত ছিল (ডেলালয় এট আল, ২০১০)। যদিও বেশিরভাগ গবেষণায় ক্যান্সার কোষগুলিতে মাইআর -9 এর জন্য একটি টিউমার-দমনকারী কার্যকলাপের ইঙ্গিত দেওয়া হয়েছে (লাইওস এট আল, ২০০৮), বিবাদী ডেটা উপস্থিত রয়েছে এবং এমআইআর -9 ফাংশনের ফলাফলটি টিউমার নির্দিষ্ট বলে মনে হয় (খাও-গুডাল এবং গুডল, ২০১০) । এমআইআর -9 স্তন ক্যান্সার, রেনাল সেল কার্সিনোমা এবং গ্যাস্ট্রিক ক্যান্সারে নিম্নোক্ত হয় প্রমোটার মেথিলিটির কারণে (লেহম্যান এট আল, ২০০৮; হিলডেব্র্যান্ড এট আল, ২০১০; সসাই এট আল, ২০১১)। বিপরীতে, এমআইআর -9 গ্লিওমাস এবং কোলোরেক্টাল ক্যান্সারে নিয়ন্ত্রিত অবস্থায় পাওয়া গেছে (মালজকর্ন এট আল, ২০১০; ঝু এট আল, ২০১২)। সাম্প্রতিক গবেষণাগুলি আরও জানিয়েছে যে এমআইআর -9 প্রদত্ত টিস্যুর মধ্যে বিজাতীয়ভাবে প্রকাশিত হয়েছে (বোনেভ এট আল, ২০১১)। আজ অবধি, এটি অস্পষ্ট থেকে যায় যে এমআর -9 এক্সপ্রেশনটি এমবি প্যাথোজেনসিসে কীভাবে অবদান রাখে। অতএব, আমরা এমবি -তে এমআর -9 এর অভিব্যক্তি, এর কার্যকরী ভূমিকা এবং এমবি রোগীদের ক্লিনিকাল ফলাফলের সাথে এর সংযোগটি অনুসন্ধান করেছি।

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

মানব এমবি প্রাথমিক নমুনা এবং সেল লাইন

এই গবেষণায় ব্যবহৃত টিউমার উপাদানগুলি সুইজারল্যান্ডের জুরিখের ইউনিভার্সিটি চিলড্রেন হাসপাতালে চিকিত্সা করা রোগীদের কাছ থেকে দুটি সংরক্ষণাগার এমবি নমুনার উত্স থেকে উদ্ভূত হয়েছে ( এন = 78; 63 ফরমালিন-ফিক্সড প্যারাফিন এমবেডড + 15 তাজা হিমায়িত)। মেথিলেশন অধ্যয়নের জন্য MB৪ এমবি নমুনা (৪ টি ফরমালিন-স্থির প্যারাফিন এম্বেড + ১৫ টা তাজা হিমায়িত) থেকে ডিএনএ উপলব্ধ ছিল। এমআরএনএ formal৩ টি ফরমালিন-স্থির প্যারাফিন-এমবেডেড নমুনাগুলির মধ্যে ১৪ টি এবং 15 টি অতিরিক্ত তাজা হিমশীতল এমবি নমুনা থেকে পাওয়া যায়। গবেষণায় ব্যবহৃত সমস্ত টিস্যু নমুনা সুইস পেডিয়াট্রিক অনকোলজি গ্রুপ (এসপিওজি) টিউমার ব্যাংক থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। টিস্যুর নমুনা সরবরাহ করে এমন প্রতিটি রোগীর কাছ থেকে লিখিত অবহিত সম্মতি পাওয়া যায়। ক্যান্সার গবেষণার উদ্দেশ্যে এসপিওজি টিউমার ব্যাংকের টিস্যু নমুনাগুলির ব্যবহার জুরিখের নৈতিক পর্যালোচনা বোর্ডের দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল (রেফারি নং স্টাভি -18 / 02)। ৮৮ টি প্রাথমিক এমবি টিউমার নমুনার জিন এক্সপ্রেশন প্রোফাইল ডক্টর টেলরের ল্যাব (হাসপাতালের জন্য অসুস্থ শিশুদের জন্য, নিউরোসার্জারি বিভাগ, টরন্টো, ওএন, কানাডা) সঞ্চালিত হয়েছিল এবং জিনের অভিব্যক্তি এবং বেঁচে থাকার বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। সাধারণ ভ্রূণের সেরিবেলা এমআরএনএ এক্সপ্রেশন অধ্যয়নের জন্য নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হত ( n = 5; গর্ভকালীন বয়স: 16-26 সপ্তাহ)। ২৮৫ টি প্রাথমিক এমবি নমুনা থেকে সর্বজনীনভাবে উপলভ্য মাইক্রোয়ারে ডেটা নির্বাচিত জিনের অভিব্যক্তি (নর্থকোট এট আল, 2012 বি) এর মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক নির্ধারণ করার জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। এমবি এক্সপ্রেশন প্রোফাইলগুলি আফফাইমেট্রিক্স হিউম্যান জিন ১.১ এসটি অ্যারে (সান্তা ক্লারা, সিএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) এ উত্পন্ন হয়েছিল। মাইক্রোয়ারে ডেটা (//r2.amc.nl) এর ভিজ্যুয়ালাইজেশন এবং বিশ্লেষণের জন্য ওপেন অ্যাক্সেস ডাটাবেস আর 2 এর মাধ্যমে ডেটা অ্যাক্সেসযোগ্য।

এমবি সেল লাইনগুলি আগে প্রকাশিত হিসাবে সংস্কৃত হয়েছিল (ভন বুয়েরেন এট আল, 2007) এবং 5% সিও 2 সহ একটি আর্দ্র পরিবেশে 37 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে বজায় ছিল। আমেরিকান প্রকার সংস্কৃতি সংগ্রহ (মানসাস, ভিএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) থেকে ডিএওওয়ির মানব এমবি কোষগুলি কিনেছিল। D341, D425, UW-228-2 এবং মেড -1 মানব এমবি কোষগুলি ডঃ হেনরি ফ্রিডম্যান (ডিউক বিশ্ববিদ্যালয়, ডারহাম, যুক্তরাজ্য) এর সদর্থক উপহার ছিল। পিএফএসকে সেলগুলি ডঃ পিটার ফিলিপস (ফিলাডেলফিয়ার চিলড্রেনস হসপিটাল, ফিলাডেলফিয়া, পিএ, ইউএসএ) এর সদুপদ উপহার ছিল।

মাইক্রোআরএনএ এবং আরএনএ বিশ্লেষণ এবং মানব প্রাথমিক এমবিগুলির প্রকাশের প্রোফাইল

মাইক্রোআরএনএ বিশ্লেষণের জন্য মোট আরএনএ নির্মাতার নির্দেশ অনুসারে মিরভানা এমআরএনএ আইসোলেশন কিট (অ্যাম্বিয়ন, লাইফ টেকনোলজি, এনওয়াই, ইউএসএ) ব্যবহার করে বিচ্ছিন্ন ছিল। পরিপক্ক মাইক্রোআরএনএগুলির প্রথম স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণের পরে মাইক্রোআরএনএ-নির্দিষ্ট তাকমান এমজিবি প্রোব ব্যবহার করে মাইক্রোআরএনএ -র জন্য আইআর -9 (আইডি 000583) এবং নিয়ন্ত্রণের জন্য ইউএন 6 ছোট পারমাণবিক 2 (আরএনইউ 6 বি) (আইডি 001093) (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস, জীবন প্রযুক্তি, কার্লসবাদ, সিএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র)। এমআরএনএ বিশ্লেষণের জন্য মোট আরএনএ প্রস্তুতকারকের নির্দেশনা অনুসরণ করে আরনিজি মিনি কিট (কিয়াজেন, বাসেল, সুইজারল্যান্ড) ব্যবহার করে উত্তোলন করা হয়েছিল। কিউআরটি – পিসিআর প্রতিক্রিয়াটির জন্য, জিন এক্সপ্রেশন মাস্টার মিক্স ব্যবহার করা হয়েছিল এবং প্রোটোকলটি এবিআই 00৯০০ এইচটি পাঠক (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস, লাইফ টেকনোলজি) এর জন্য অনুকূলিত হয়েছিল। নিম্নলিখিত জিনগুলির জন্য নির্দিষ্ট প্রোব-প্রাইমার সমাধানগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: HES1 (Hs00172878_m1), p21 (Hs00355782_m1), এমএএসএইচ 1 / এএসসিএল 1 ( Hs00269932_m1), NEUROD1 (Hs00159598_m1), এমএপি 1 (Hs00158900_m1, Hs00258900_m1) (Hs00707120_s1), এবং TUBB3 (Hs00964962_g1)। সাধারণ মানব সেরিবেলাম একটি রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহৃত হত (ক্লোনটেক-টাকারা বায়ো ইউরোপ, সেন্ট জার্মেইন-এন-লে, ফ্রান্স)। GeneC টি পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রতিটি জিনের জন্য আপেক্ষিক জিনের অভিব্যক্তি গণনা করা হয়েছিল, যেখানে চক্রের থ্রেশহোল্ড (সি টি ) মানগুলি গৃহকর্মী জিনগুলি আরএনএ, ইউ 6 ছোট নিউক্লিয়ার 2 ( আরএনইউ 6 বি ), ডিহাইড্রোজেনেস কমপ্লেক্স সাবুনিট এ ( এসডিএইচ ) সংহত করা হয়েছিল (Hs00188166_m1), এবং 18 এস (Hs99999901_s1) (ফলিত বায়োসিস্টেমস, জীবন প্রযুক্তি)।

এমআইআর -9 জিনের প্রচারক মেথিলেশন বিশ্লেষণ

এমআইআর -9-1 , -2 , এবং -3 জিনের প্রোমোটার মেথিলিপশন অবস্থা এমবি সেল লাইনে মেথিলিকেশন-নির্দিষ্ট পিসিআর (এমএসপি) এবং এমবি টিস্যুগুলির 64 প্রাথমিক নমুনাগুলি দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নির্মাতার নির্দেশ অনুসরণ করে ইজেড ডিএনএ মেথিলিটিশন কিট (জাইমো রিসার্চ কো।, ইরভিন, সিএ, মার্কিন) ব্যবহার করে ডিএনএর বিস্ফ্লাইট রূপান্তরকরণ করা হয়েছিল। এমএস-পিসিআর-র জন্য ব্যবহৃত প্রাইমর এবং প্রোটোকলগুলি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে (লুজাম্বিও এট আল, ২০০ 2008; ব্যান্ড্রেস এট আল, ২০০৯)। প্রতিটি এমএস-পিসিআর প্রতিক্রিয়ার জন্য, সার্বজনীন মেথিলেটেড ডিএনএ (কেমিকন ইন্টারন্যাশনাল, টেমেকুলা, সিএ, ইউএসএ) নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ এবং সাধারণ লিম্ফোসাইট ডিএনএ হিসাবে অন্তর্ভুক্ত ছিল। প্যারাফিন বিভাগগুলিতে সাধারণ টিস্যুর নমুনাগুলি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হত। পিসিআর পণ্যগুলি একটি 3% আগারোজ জেল দিয়ে চালিত হয়েছিল এবং ইউভি ট্রান্স-আলোকসজ্জা (বায়ো-রেড, হারকিউলিস, সিএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) দ্বারা দৃশ্যমান হয়েছিল। > 25% ডিএনএ মেথিলিট করা থাকলে মেথিলিটেড ব্যান্ডগুলি সনাক্তযোগ্য ছিল। একইভাবে, সমস্ত ডিএনএ নিখরচায় থাকাকালীন মেথিলিটেড ব্যান্ডগুলি সনাক্তযোগ্য ছিল না এবং বিপরীতে, পদ্ধতির সংবেদনশীলতা এবং নির্দিষ্টতা নিশ্চিত করে।

সিলিকোতে এমআইআর -9 লক্ষ্য জিনগুলির জন্য অনুসন্ধান করুন

এমআইআর -9-এইচইএস 1 ইন্টারঅ্যাকশন সম্পর্কিত ভবিষ্যদ্বাণীগুলি ডেটাবেসগুলি থেকে মিআরএনএ লক্ষ্যক্রমের অনুক্রমের পূর্বাভাস দেওয়া হয়েছিল, উদাহরণস্বরূপ, টার্গেটস্ক্যান (লুইস এট আল, 2003), পিকচার (ক্রেক এট আল, 2005), ডিআইএনএ-মাইক্রোটি 3.0 3.0 অ্যালগরিদম (মারাগাকাকিস এট আল, ২০০৯) এবং মাইক্রোএনএএনএ.আর.অর্গ (বেটেল এট আল, ২০০৮) বা ডাটাবেসগুলি থেকে যেগুলি স্টারবেস ভি ২.০ (ইয়াং এট আল, ২০১১), মাইক্রোপিআইআর (পিরিয়াপংসা এট আল, ২০১২) এর মতো সম্ভাব্য টার্গেট জিনগুলিতে এমআইআরএনএ বাইন্ডিং সাইটগুলির পূর্বাভাস দিতে পারে, এবং মিআরওয়াক (দ্বীপ এট আল, ২০১১)।

পাশ্চাত্য ব্লোটিং এবং ইমিউনোফ্লোরাসেন্স বিশ্লেষণ

পূর্বে প্রকাশিত হিসাবে পশ্চিমা ব্লটিং বিশ্লেষণগুলি করা হয়েছিল (ফায়াসেস্তি এট আল, ২০১১)। ঝিল্লিগুলি নিম্নলিখিত প্রথম অ্যান্টিবডিগুলির সাথে সংক্রামিত হয়েছিল: এইচইএস 1 (এইচ -140) (স্ক-25392, সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি, সান্তা ক্রুজ, সিএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র), t -তুবুলিন ক্লাস তৃতীয় (টিউবিবি 3) (2 জি 10) (Ab78078, অ্যাব্যাকাম, কেমব্রিজ), ইউকে), এমএএসএইচ 1 / অ্যাকিয়েট-স্কুট হোমোলজ 1 (অ্যাব 3 8557, অ্যাব্যাকাম), এবং সিপ 1 / ডাব্লুএএফ -1 / পি 21 (সিপি 74) (পি 1484, সিগমা-অ্যালড্রিচ, বুচস, সুইজারল্যান্ড)। প্রোটিন সনাক্তকরণ সুপারসিগনাল ওয়েস্টার্ন বায়ো কেমো লুমিনেসেন্ট সাবস্ট্রেট (পিয়েরস, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, রকফোর্ড, আইএল, ইউএসএ) দিয়ে সঞ্চালিত হয়েছিল। ct -আ্যাক্টিন (এসি -৪৪) (A5316, সিগমা-অলডরিক) লোডিং নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। ইমিউনোফ্লোরোসেন্স স্টেনিংয়ের জন্য, কোষগুলি 4% পিএফএতে স্থির করা হয়েছিল এবং 10% এফসিএস এবং 0.5% ট্রাইটনযুক্ত মিডিয়ামে ব্লক করা হয়েছিল। এনইএস (196908) (এমএবি 1259, আর অ্যান্ড ডি সিস্টেমস, মিনিয়াপলিস, এমএন, ইউএসএ) এবং টিউবিবি 3 (অ্যাব 7080, অ্যাব্যাকাম) এর জন্য রাত্রে 4 ডিগ্রি সেল সেলগুলি দাগ দেওয়া হয়েছিল ained অ্যালেক্সা ফ্লুর 488 বা 594 (1/200) (ইনভিট্রোজেন, লাইফ টেকনোলজি) অ্যান্টিবডিগুলি গৌণ অ্যান্টিবডি হিসাবে ব্যবহৃত হত। সমস্ত স্টেইনিংগুলি অ্যাক্সিস্কোপ 2 মোট প্লাস ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ (জিসিস, জেনা, জার্মানি) দিয়ে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

কোষ চক্র এবং অ্যাপোপটোসিস বিশ্লেষণ

এমবি কোষগুলি কাটা হয়েছিল, পিবিএস ধুয়েছে এবং অবিলম্বে 5 মিলি বরফ-ঠান্ডা 70% ইথানল স্থির করা হয়েছে। প্রবাহের সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণের আগে, কোষগুলি 300 μ l প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড দ্রবণে পুনরায় সেট করা হয়, আরএননেসের 2 μ l (100 মিলিগ্রাম মিলি -1 ) যোগ করা হয়েছিল এবং 45 মিনিটের জন্য কোষগুলি 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস ইনকিউবিটেড হয়েছিল। নির্মাতার প্রস্তাবিত প্রোটোকলের পরে বিডি এএফএসিএস ক্যান্টো II যন্ত্রের (বিডি বায়োসায়েন্সস, ফ্র্যাঙ্কলিন লেকস, এনজে, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। DIVA সফ্টওয়্যার (বিডি বায়োসেসেন্স) দিয়ে ডেটা সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং যথাযথ নিয়ন্ত্রণ এবং গেটগুলি ব্যবহার করে ফ্লোজো সফ্টওয়্যার (ট্রিস্টার ইনক। অ্যাসল্যান্ড, ওআর, ইউএসএ) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

ক্যাসপেস-গ্লোব 3/7 Assay (প্রোমেগা কর্পোরেশন, মেডিসন, ডাব্লুআই, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে ক্যাস্পেস 3 এবং 7 সক্রিয়করণ সনাক্ত করা হয়েছিল। অ্যানেক্সিন ভি – এপিসি স্টেইনিং (550475, বিডি বায়োসেসেন্স) ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। সেল ডেথ ডিটেকশন ইলিসা প্লাস অ্যাস (রোচে ডায়াগনস্টিকস, রটক্রুজ, সুইজারল্যান্ড) দ্বারা হোনস্টোন-সম্পর্কিত ডিএনএ টুকরো পরিমাণের মাধ্যমে অ্যাওপটোসিস আনয়ন নিশ্চিত করা হয়েছিল।

সেল ট্রান্সফেকশন এবং 5-আজা -2′-ডিউক্সাইসাইটিডিন (5-আজা) চিকিত্সা

কোষগুলি যথাক্রমে 4 × 10 4 (ডিএওওয়াই, পিএফএসকে) এবং 2 × 10 5 (ডি 341, ডি 425) এর ঘনত্বের ছয়টি ওয়েল প্লেটে সিড করা হয়েছিল। প্রি - এমআইআর -9 (পিএম 10022, অ্যাম্বিয়ন) বা 30 টি এনএমএল এল -1 এর চূড়ান্ত ঘনত্বের হিসাবে স্ক্র্যাম্বলড (এএম 17110, অ্যাম্বিয়ন) হিসাবে উল্লেখিত নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ অলিগোনুক্লিয়োটাইডের সংক্রমণ নির্মাতার সুপারিশ অনুসারে সিআইওআরপি নিওএফএক্স ট্রান্সফেকশন রিএজেন্ট (অ্যাম্বিয়ন) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল । ট্রান্সফেকশন দক্ষতা একটি এফএএম-লেবেলযুক্ত প্রাক - এমআইআর -9 নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণের (এএম 17121, অ্যাম্বিয়ন) 24 ঘন্টা পোস্ট ট্রান্সফেকশনের সাথে মূল্যায়ন করা হয়েছিল। এফএএম-পজেটিভ কোষগুলি একটি প্রতিপ্রভ মাইক্রোস্কোপের অধীনে গণনা করা হয়েছিল এবং মোট কোষের শতাংশ হিসাবে প্রকাশিত হয়েছিল। প্রতিটি নমুনার জন্য ছয়টি এলোমেলো ক্ষেত্র গণনা করা হয়েছিল। ডিএওওয়াই এবং পিএফএসকে কোষগুলি (70-80% সঙ্গম) 20 এন এম চূড়ান্ত ঘনত্বের মধ্যে এইচইএস 1 সিআরএনএ (আইডি 6922, অ্যাম্বিয়ন, সিল্যান্সার প্রাক-নকশা করা সিআরএনএ) ব্যবহার করে স্থানান্তরিত হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, সাইলেন্সার নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ সিআরএনএ নং। 1 (এএম 4611, অ্যাম্বিয়ন) একই পরিস্থিতিতে ব্যবহার করা হয়েছিল। পরবর্তী পরিমাণগত QRT – পিসিআর এবং পশ্চিমা ব্লটিং বিশ্লেষণের জন্য স্থানান্তরকরণের পরে কক্ষগুলি 48 এবং 72 ঘন্টা কাটা হয়েছিল। কোষগুলি ছয়টি ভাল প্লেটে ধাতব ধাতুপট্টাবৃত ছিল এবং আরও বিশ্লেষণের আগে ২৪-৪৮ ঘন্টা ধরে 0.1 মি এম 5-আজা (এ 3656; সিগমা-অ্যালড্রিক) বা নিয়ন্ত্রণ (ডিএমএসও) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল।

3′UTR রিপোর্টার প্লাজমিড এবং লুসিফেরেস অ্যাসেস নির্মাণ

পিএফএসকে সেলের জিনোমিক ডিএনএ (এফডাব্লু: 5′-এএএএসিটিসিগ্যাএএজিসিএজিটিজিটিসিটিসিটিসিটিসিসি -3 RE, আরই: 5′-এএএএএসিএসিএজিসিটিসিটিএসিএজিটিসিটিএসিএজিএটিসিটিএগা) আইটিএইচসিএটিসিটিগাটিসিএসিএপিসিআর-থেকে এমপিআরআই 9-র বাইন্ডিং সাইট যুক্ত এইচইএস 1 এর 3′UTR এর একটি 459-বিপি খণ্ড। 459-বেস জুটি বিভাগটি XhoI এবং নোটআই সাইটগুলি ধারণ করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল এবং XhoI এবং নোটআই সাইটের মধ্যে psiCHECK-2 ভেক্টর (প্রেমেগা কর্পোরেশন) এ ক্লোন করা হয়েছিল, রেনিলা লুসিফ্রেজ জিনের অবিলম্বে 3 ′ নিম্ন প্রবাহে। সমস্ত নির্মাণগুলি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল। লিপোফেকটামিন -২০০০ (ইনভিট্রোজেন) ব্যবহার করে একটি ৯৯ টি ওয়েল প্লেটে দশ ন্যানোগ্রাম সিসিএইচকে -২ কনস্ট্রাক্ট 10 এন এম মিআর -9 ডুপ্লেক্স বা স্ক্র্যাম্বড ডুপ্লেক্সকে এইচকে -২৯৩ টি কোষে সহ-স্থানান্তরিত হয়েছিল। 48 ঘন্টা পরে, সেল এক্সট্রাক্ট প্রাপ্ত হয়েছিল; ফায়ার ফ্লাই এবং রেনিলা লুসিফেরেস ক্রিয়াকলাপগুলি প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে ডুয়াল-লুসিফেরেস রিপোর্টার সিস্টেম (প্রোমেগা কর্পোরেশন) দিয়ে পরিমাপ করা হয়েছিল।

পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

সমস্ত পরীক্ষাগুলি কমপক্ষে ত্রি-তিনটি ক্ষেত্রে করা হয়েছিল। ডেটা গড় ± sd হিসাবে উপস্থাপন করা হয় ভিট্রো পরীক্ষার জন্য শিক্ষার্থীর টি-টেস্ট ব্যবহার করা হত। <0.05 এর পি- মূল্যগুলি তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। পিয়ারসনের পারস্পরিক সম্পর্ক পরীক্ষা রোগীর নমুনায় জিনের সম্পর্কের জন্য ব্যবহৃত হত।

ফলাফল

টিউমার-নির্দিষ্ট সিপিজি দ্বীপের হাইপারমেথিলিটিশন এমবি কোষগুলিতে এমআইআর -9 এর অভিব্যক্তিকে হ্রাস করে

এমবি -তে এমআর -9 এর অভিব্যক্তিটি অন্তর্দৃষ্টি পেতে, আমরা এমবি প্রাথমিক নমুনার ( এন = 29) এবং ছয় এমবি-প্রাপ্ত কোষের লাইনের একটি সংখ্যার বিশ্লেষণ করেছি। সাধারণ মানব ভ্রূণের সেরিবেলামের সাথে তুলনা করে এমআইআর -9 এর একটি হ্রাসপ্রকাশের মাত্রা বেশিরভাগ এমবি টিউমার টিস্যুতে (চিত্র 1 এ, এবং পরিপূরক চিত্র এস 1 এ) এবং পরীক্ষিত ছয় এমবি কোষ লাইনে (চিত্র 1 বি, উপরের প্যানেল) পরিলক্ষিত হয়েছিল। এমআইআর -9 ডাউনগ্রুলেশনটি এমবিতে একটি সাধারণ বৈশিষ্ট্য কিনা তা নিশ্চিত করতে, আমরা আণবিক উপগোষ্ঠী তথ্য সহ প্রাথমিক এমবি ( এন = 88) এর একটি স্বতন্ত্র, নন-ওভারল্যাপিং কোহর্টে আমাদের অনুসন্ধানগুলি বৈধ করেছি। জিনগত ব্যাকগ্রাউন্ড (চিত্র 1 সি) নির্বিশেষে এমআইআর -9 এক্সপ্রেশনটি সাধারণ ভ্রূণের সেরিবিলামের তুলনায় এমবি টিউমার নমুনার (91%, 80/88) বড় সাবসেটে কম পাওয়া গেছে। চার এমবি মলিকুলার সাব টাইপগুলি জুড়ে, এমআইআর -9 ডাউনগ্রুলেশনটি ডাব্লুএনটি এবং গ্রুপ 3 উপগ্রুপগুলিতে সর্বাধিকভাবে প্রকাশিত হয়েছিল, যা এমওয়াইসি প্রোটো-অ্যানকোজিন (চিত্র 1 সি এবং পরিপূরক চিত্রসমূহ এস 1 বি এবং সি) এর উচ্চ প্রকাশ দ্বারা চিহ্নিত হয়। বিপরীতে, গ্রুপ 4 টি টিউমার, যা নিউরোনাল পার্থক্যের সাথে জড়িত উচ্চ স্তরের জিনের অভিব্যক্তি দ্বারা চিহ্নিত হয়, সাধারণ সেরিবিলার নমুনাগুলির সাথে তুলনীয় অন্যান্য উপগোষ্ঠীর তুলনায় উচ্চতর এমআর -9 স্তর প্রদর্শন করে।

Image

এমআইআর -9 এর এক্সপ্রেশনটি এমপি কোষগুলিতে এপিগনেটিকালি দমন করা হয়। 15 টি টাটকা, হিমায়িত এমবি প্রাথমিক নমুনায় এবং ( বি ) সূচিত এমবি সেল লাইনে QRT – PCR ( A ) দ্বারা নির্ধারিত আপেক্ষিক miR-9 এক্সপ্রেশন। মানগুলি সাধারণ সেরিবেলামের সাথে মিয়ার -9-2 এমআরএনএ অভিব্যক্তির ভাঁজ হ্রাস উপস্থাপন করে। বিন্দুযুক্ত রেখাটি স্বেচ্ছাসেবক স্তরের স্বেচ্ছাসেবকের মান = 1 নির্দেশ করে। ( এবং বি, নিম্ন প্যানেল) সংবাদদাতা এমবি নমুনা এবং সেল লাইনগুলিতে তিনটি এমআর -9 জিনের মেথিলেশন স্থিতি। ( সি ) বাক্স প্লটগুলি ভ্রূণের সেরিবেলামের সাথে তুলনা করে এমবি সাবগ্রুপগুলিতে এমআর -9-2 এর আপেক্ষিক প্রকাশ দেখায়। আপেক্ষিক অভিব্যক্তি হ'ল জিন প্রোব সিগন্যালের আলোকিততার একটি পরিমাপ, প্রতিটি অ্যারের ব্যাকগ্রাউন্ড আলোকসজ্জার জন্য সংশোধন করা হয়েছে এবং বিভিন্ন অ্যারে জুড়ে নিয়ন্ত্রণ প্রোব ব্যবহার করে সাধারণীকরণ করা হয়। ( ডি ) কিউআরটি 5 এমআর -9 এর পিসিআর বিশ্লেষণ সূচিত মানব এমবি সেল লাইনে 5-আজা বা নিয়ন্ত্রণ (ডিএমএসও) দ্বারা চিকিত্সা করা। (* পি <0.05, ** পি <0.01, *** পি <0.001 শিক্ষার্থীর টেস্টেস্ট অনুসারে।) ( ) 49 এফএফপিইতে তিনটি এমআইআর -9 জিনের সিপিজি দ্বীপ অঞ্চলের এমএস-পিসিআর পণ্যগুলি দেখায় আগারোজ জেল এমবি প্রাথমিক নমুনা। নিম্ন প্যানেলটি সংশ্লিষ্ট এমবি নমুনাগুলিতে তিনটি এমআর -9 জিনের মেথিলিকেশন স্থিতি উপস্থাপন করে। সংক্ষিপ্তসার: এম = মেথিলেটেড; এনসি = নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ; এনএস = উল্লেখযোগ্য নয়; পিসি = পজিটিভ নিয়ন্ত্রণ; ইউ unmethylated =।

পূর্ণ আকারের চিত্র

টিউমার-দমনকারী জিনগুলি সিপিজি প্রবর্তক হাইপারমিথিল্যানেশন (এসটেলার, 2002) সহ বিভিন্ন উপায়ে নিষ্ক্রিয় করা যায়। আমাদের প্রাথমিক তদন্তে এমবি কোষগুলিতে এমআইআর -9 জিন কোনও অপসারণের বিষয়টি প্রকাশিত হয়নি (পরিপূরক চিত্র এস 1 ডি)। হাইপারমিথিলিকেশন এমবি কোষগুলিতে এমআইআর -9 এক্সপ্রেশন হ্রাস পেয়েছে কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য, আমরা এমএসপি দ্বারা এইচএসএ - এমআইআর -9 এর প্রবর্তক অঞ্চলগুলির মেথিলিকেশন পরীক্ষা করেছি। Hsa -miR-9 তিনটি জিনোমিক লোকি hsa- miR-9-1 (1Q22), hsa- miR-9-2 (5q14.3), এবং hsa- miR-9-3 (15q26.1) (বান্দ্রেস) দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়েছে এট আল, ২০০৯)। তিনটি লোকই মাইআর -9 এর অভিব্যক্তিটিতে স্বতন্ত্রভাবে অবদান রাখতে পারে। সাধারণ সেরিবেলামের বিপরীতে, তিনটি এমআর -9 লোকি স্বল্পভাবে এমআইআর -9 এক্সপ্রেশন সহ প্রাথমিক নমুনার সাবসেটে এবং পরীক্ষিত সমস্ত এমবি সেল লাইনে (চিত্র 1 এ এবং বি, নিম্ন প্যানেল) স্বতন্ত্রভাবে মেথিলিট করা হয়েছিল।

মেথিলিকেশন এবং নিম্ন এমআর -9 এক্সপ্রেশন স্তরের মধ্যে কার্যকারক সম্পর্ক স্থাপন করতে আমরা এমবি কোষকে ডেমিথিলটিং এজেন্ট 5-আজার সাথে চিকিত্সা করেছি। 5-আজার সাথে চিকিত্সার পরে, এমআর -9 এক্সপ্রেশনটি ডিবি 341 কোষ ব্যতীত সমস্ত এমবি সেল লাইনে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে, যেখানে এমআইআর -9 সাইলেন্সিংয়ে প্রমোটার মেথিলিয়েশনের ভূমিকা নিশ্চিত করে, কেবলমাত্র একটি ছোট বৃদ্ধি লক্ষ্য করা গেছে (চিত্র 1 ডি)। ক্লিনিক্যালি আরও প্রাসঙ্গিক মডেলটিতে hsa -miR-9 এর এপিজেনেটিক রেগুলেশনের ভূমিকা নির্ধারণের জন্য, এমএসপি বিশ্লেষণ ব্যবহার করে তিনটি হ্যাশ - এমআইআর -9 জিনের প্রবর্তক মেথিলিকেশন অবস্থা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল MB৪ এমবি নমুনার একটি প্যানেলে। এমবি রোগীদের 78% (50/64) রোগীদের মধ্যে, তিনটি এমআইআর -9 লোকির মধ্যে কমপক্ষে একজন প্রমোটার মেথিলেশন (চিত্র 1 এ, নিম্ন প্যানেল এবং 1 ই) দেখিয়েছেন। বিশেষত, এমআইআর -9-1 এর প্রবর্তক অঞ্চলগুলি %৪% (৪১/6464) এবং মাইআর - ৯-২ -এ মেথিলিট করা হয়েছে 73৩% (৪ me / 6464), যেখানে এমআইআর -৯-৩ এর প্রবর্তক ৩৪ -তে মাইথিলিট করা হয়েছে এমবি ক্ষেত্রে% (23/64)। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত করে যে এমবি টিস্যু নমুনাগুলি এবং কোষের লাইনে পাওয়া মিআর -9 এর হ্রাসপ্রবণতা সম্ভবত তিনটি প্রাক - এমআইআর -9 প্যারালজাস লোকির মধ্যে এক বা একাধিক ক্ষুদ্রতর মেথিলিয়েশনের কারণে ঘটে।

এমওয়াইসি এমবিতে এমআইআর -9 স্তর নিয়ন্ত্রণের সাথে জড়িত

এমবি রোগজীবাণু (নর্থকোট এট আল, ২০১২ বি) এবং এমআইআর -9 (মা এট আল, ২০১০) এর প্রবর্তক অঞ্চলে সরাসরি আবদ্ধ হওয়ার দক্ষতার ক্ষেত্রে এমআরসি অবারেন্ট এমওয়িসির বিশিষ্ট ভূমিকা এবং আমরা এমআইআর এমআইআর নিয়ন্ত্রণে জড়িত কিনা তা খতিয়ে দেখেছি এমবি কোষে -9 প্রকাশ। ২৮৫ এমবি'র জিন এক্সপ্রেশন প্রোফাইলগুলির বিশ্লেষণে এমআইআর -9 স্তর এবং প্রাথমিক টিউমার নমুনায় এমওয়াইসি এক্সপ্রেশন (চিত্র 2 এ) এর মধ্যে একটি পরিসংখ্যানগতভাবে গুরুত্বপূর্ণ নেতিবাচক পারস্পরিক সম্পর্ক প্রকাশিত হয়েছে। এমওয়াইসি এবং এমআইআর -9 এর এক্সপ্রেশন স্তরগুলি এমবি সেল লাইনের একটি প্রতিনিধি প্যানেলে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল তখন একটি অনুরূপ বিপরীত পারস্পরিক সম্পর্ক পরিলক্ষিত হয়েছিল। এমওয়াইসি-র নিম্ন স্তরের (ডিএওওয়াই এবং পিএফএসকে) বহনকারী সেল লাইনগুলিতে এমআইআর -9 এর মাত্রা বেশি ছিল, উচ্চ- এমওয়াইসি কোষ (ডি 341 এবং ডি 425) মাইআর -9 (চিত্র 2 বি) এর তুলনামূলকভাবে কম অভিব্যক্তি দেখিয়েছিল। এই সন্ধানটি যাচাই করার জন্য, আমরা এমবিসি (DAOY-MYC) এমটিসি কোষগুলিতে এক্সট্রোপলিকভাবে ওভাররেপ্রেসিংয়ের এমআইআর -9 এর স্তরটি পরীক্ষা করে এটিকে ফাঁকা-ভেক্টর-ট্রান্সফেক্টেড কোষগুলির সাথে তুলনা করে (লো এমওয়াইসি-ডিএওওয়াই সেল) (স্টার্নস এট আল, 2006)। এমওয়াইসি ওভার এক্সপ্রেশনের ফলে এমআইআর -9 এক্সপ্রেশন (চিত্র 2 সি) এর 30% হ্রাস পেয়েছে, এমবি কোষগুলিতে এমআরআই -9 এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণের ক্ষেত্রে এমওয়াইসির জড়িত থাকার পরামর্শ দেয়।

Image

অনকোজিন এমওয়াইসি এমআইআর -9 এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণের সাথে জড়িত। ( ) মাইক্রোয়ারে-ভিত্তিক এক্সপ্রেশন প্রোফাইলগুলি দ্বারা নির্ধারিত হিসাবে 285 এমবি রোগীদের নমুনা ডেটা সেটগুলিতে এমআইআর -9 এবং এমওয়াইসি এমআরএনএ এক্সপ্রেশনের মধ্যে সম্পর্ক রয়েছে (উত্তরকোট এট আল, 2012 বি; আর = পিয়ারসনের সহসংযোগ সহগ)। ( ) এমআরসি-র আপেক্ষিক এমআরএনএ অভিব্যক্তি (বাম y অক্ষ) এবং মিআর -9 (ডান y অক্ষ) এর প্রকাশ যেমন কিউআরটি – পিসিআর দ্বারা নির্ধারিত হয়েছে। ( সি ) এমওয়িসি সম্পর্কিত আপেক্ষিক এমআরএনএ এক্সপ্রেশন (বাম y অক্ষ) এবং খালি-ভেক্টর-ট্রান্সফেক্টড ডিএওওয়াই কোষে (ডাই ওয়াই অক্ষ) মাইআর -9 (ডান y অক্ষ) এর এক্সপ্রেশন এবং এমওয়াইসি-ট্রান্সফেক্টেড ডিএওওয়াই কোষগুলিতে (উচ্চ এমওয়াইসি) দ্বারা নির্ধারিত qRT-পিসিআর। ( ডি ) এমআরসি-স্থানান্তরিত ডিএওওয়াই কোষগুলিতে এমআর -9 এর আপেক্ষিক প্রকাশ QRT – পিসিআর দ্বারা নির্ধারিত 5 ঘন্টা-চিকিত্সার 24 ঘন্টা উপর। (* পি <0.05, ** পি <0.01, *** পি <0.001 শিক্ষার্থীদের টি-টেস্ট অনুযায়ী।)

পূর্ণ আকারের চিত্র

বেশ কয়েকটি এমআরএনএ'র এমওয়াইসি-মধ্যস্থতাপূর্ণ দমন রিপোর্ট করা হয়েছে (চ্যাং এট আল, ২০০, ; বুই এবং মেন্ডেল, ২০১০), যদিও অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াগুলি পুরোপুরি পরিষ্কার করা হয়নি (ফ্রেঞ্জেল এট আল, ২০১০)। এমবিতে এমআইআর -9 এর নিম্ন- নিয়ন্ত্রণের মধ্যস্থতা করার জন্য এবং তার পিছনের প্রক্রিয়াগুলির বিষয়ে আলোকপাত করার জন্য এমওয়াইসির সক্ষমতা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা অনুসন্ধান করেছিলাম যে এমওয়াইসি-মধ্যস্থতাযুক্ত এমআর -9 দমন করার জন্য ডিএনএ মেথিলেশন প্রয়োজন কিনা। প্রকৃতপক্ষে, এমওয়াইসি-প্ররোচিত এমআইআর -9 দমনটি 5-আজা চিকিত্সা দ্বারা প্রতিহত করা হয়েছিল, এটি প্রস্তাব করে যে অ্যানকোজিন এমওয়াইসি এমআইআর -9 প্রবর্তকের ডিএনএ মেথিলেশন স্থিতি নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে এমআইআর -9 স্তর হ্রাসের সাথে জড়িত রয়েছে।

miR-9 এমবিতে মানব HES1 জিনের অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করে

এমবিআর -9 এর এমবি টিউমার জীববিজ্ঞানের সম্ভাব্য সংক্রামণের সাথে চিহ্নিত লক্ষ্যমাত্রা সনাক্ত করতে আমরা বেশ কয়েকটি স্বতন্ত্র ডাটাবেস ব্যবহার করে সিলিকো অনুসন্ধান চালিয়েছি। মানুষের মধ্যে টার্গেট সাইট সংরক্ষণের উপর ভিত্তি করে সম্ভাব্য এমআইআর -9 টার্গেটগুলির মধ্যে, স্বতন্ত্র প্রোগ্রামগুলি এইচইএস 1 (বিভাজন 1 এর লোমশ এবং বর্ধক) জিনকে এমআইআর -9 (চিত্র 3 এ এবং পরিপূরক চিত্র এস 2 এ) এর সম্ভাব্য লক্ষ্য হিসাবে চিহ্নিত করেছে। যেহেতু এইচইএস 1 এর সাধারণ মস্তিষ্কের বিকাশের এবং এমবি প্যাথোজেনেসিসে কেন্দ্রীয় ভূমিকা রয়েছে (হাল্লাহান এট আল, 2004; ডাকুবো এট আল, 2006; ডি বন্ট এট আল, ২০০৮; ইনগ্রাম এট আল, ২০০)), তাই আমরা আমাদের আরও তদন্ত এমআইআরের উপর ফোকাস করার সিদ্ধান্ত নিয়েছিলাম -9- এইচইএস 1 এর মধ্যবর্তী নিয়ন্ত্রণ।

Image

miR-9 এমবি কোষগুলিতে HES1 এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণ করে। ( ) এইচইএস 1 প্রবর্তক (বীজ-পরিপূরক অঞ্চল) এর 3′UTR তে পূর্বাভাসযুক্ত এমআর -9 বাইন্ডিং সাইটের সিকোয়েন্স সারিবদ্ধকরণ। ( বি - ডি ) এমআরআর -9 এবং এইচইএস 1 এক্সপ্রেশনের সহসংযোগ অধ্যয়ন এমবিআর রোগীদের তিনটি স্বতন্ত্র সেটগুলিতে কিউআরটি – পিসিআর দ্বারা নির্ধারিত এবং মাইক্রোআর-ভিত্তিক এক্সপ্রেশন প্রোফাইল দ্বারা নির্ধারিত। ( r = পিয়ারসনের পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ)। ( ) এমবি সাবগ্রুপস (ডাব্লুএনটি, এসএইচএইচ, গ্রুপ 3, গ্রুপ 4) ( এন = 88) অনুসারে এইচইএস 1 এবং এমআইআর -9 স্তরের সম্পর্ক সম্পর্কিত অধ্যয়ন। ( ) 293T কোষে লুসিফেরেস রিপোর্টার ক্রিয়াকলাপটি প্রি - এমআইআর -9 বা নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণের সাথে সংক্রমণযুক্ত এবং ফায়ারফ্লাই লুসিফেরেস রিপোর্টার জিনের প্রবাহে HES1 জিনের 3′UTR সমেত পিসচেক 2 ভেক্টরের সাথে সহ-সংক্রামিত হয়েছিল। ( ) QRT – PCR 48 ঘন্টা দ্বারা নির্ধারিত হিসাবে সম্পর্কিত এমআর -9 এক্সপ্রেশনটি পূর্ব-এমআইআর -9 বা সংকেত এমবি সেল লাইনে নিয়ন্ত্রণ দ্বারা অনুসরণ করা হয় cell মানগুলি নিয়ন্ত্রণের তুলনায় এমআর -9 এমআরএনএর ভাঁজ বৃদ্ধি উপস্থাপন করে। (* পি <0.05, ** পি <0.01, *** পি <0.001 শিক্ষার্থীদের টি-টেস্ট অনুসারে।) ( এইচ ) একটি প্রতিনিধি প্রতিরোধমূলক পরীক্ষায় HES1 প্রোটিনের এক্সপ্রেশনকে প্রাক - মাইআর -9 মধ্যস্থতা হ্রাস করতে পারে।

পূর্ণ আকারের চিত্র

এমবি -তে এমআরআর -9 / এইচইএস 1 ইন্টারঅ্যাকশনটির অন্তর্দৃষ্টি পেতে আমরা এমবি প্রাথমিক নমুনায় HES1 এবং miR-9 ট্রান্সক্রিপ্টগুলির তুলনা করেছি। 15 এমবিএসের একটি পাইলট বিশ্লেষণে এইচইএস 1 এবং এমআইআর -9 স্তরগুলির চিত্র (চিত্র 3 বি) এর মধ্যে সামান্য বিপরীত পারস্পরিক সম্পর্ক প্রকাশ করেছে। এই গবেষণাগুলি আরও প্রমাণিত করার জন্য, আমরা 285 এবং 88 প্রাথমিক এমবি টিউমার (নর্থকোট এট আল, 2012 বি) এর দুটি স্বতন্ত্র সেটগুলিতে HES1 এবং miR-9 ট্রান্সক্রিপ্টগুলির মধ্যে সম্পর্কের বিশ্লেষণ করেছি। বিশ্লেষণটি নিশ্চিত করেছে যে এমআইআর -9 এবং এইচইএস 1 এক্সপ্রেশন স্তরগুলি উভয় ডেটা সেটগুলিতে বিপরীতভাবে সম্পর্কযুক্ত (চিত্র 3 সি এবং ডি; পরিপূরক চিত্র এস 2 বি এবং সি)। এমবি সুগারুপগুলির বিশ্লেষণে এমএআর -9 এবং এইচইএস 1 এর মধ্যে এসএইচএইচ, গ্রুপ 3 এবং গ্রুপ 4 এমবি উভয় এমবি রোগীর নমুনার (চিত্র 3 ই এবং পরিপূরক চিত্র এস 2 ডি) জুড়ে একটি নেতিবাচক সম্পর্ক রয়েছে। অন্যান্য উপগোষ্ঠীর বিপরীতে, ডাব্লুএনটি টিউমারগুলি এমআইআর -9 এবং এইচইএস 1 এক্সপ্রেশনের মধ্যে একটি ইতিবাচক পারস্পরিক সম্পর্ক দেখিয়েছে। যদিও এই পর্যবেক্ষণকে বৈধতা দেওয়ার জন্য বিশ্লেষিত দলটিতে ডাব্লুএনটি নমুনার সংখ্যা যথেষ্ট পরিমাণে বড় নয়, ডাব্লুএনটি ক্ষেত্রে বিশ্লেষণ করে প্রাপ্ত অপ্রত্যাশিত ফলাফলগুলি ডাব্লুএনটি উপগোষ্ঠীর মধ্যে বিদ্যমান একটি স্বতন্ত্র মাইক্রোআরএনএ স্বাক্ষরকে প্রতিফলিত করতে পারে (গোখলে এট আল, ২০১০)।

HES1 এক্সপ্রেশনটির miR-9 নিয়ন্ত্রণ কার্যকরীভাবে বৈধকরণের জন্য, আমরা বুনো টাইপ HES1 3′UTR অনুক্রম বা মাইর -9 বীজ-পরিপূরক অঞ্চলে একটি রূপান্তর বহন করে এমন একটি অনুক্রমের সাথে সংযুক্ত একটি লুসিফেরেস সাংবাদিককে ডিজাইন করেছি। 293T কোষে বন্য-প্রকারের লুসিফেরেস প্রতিবেদকের অভিব্যক্তি স্ক্র্যাম্বলড পূর্ববর্তীদের সাথে তুলনা করে এমআইআর -9 পূর্ববর্তী মিমিক্স (প্রাক -এমআইআর -9 ) দ্বারা উল্লেখযোগ্যভাবে দমন করা হয়েছিল, যেখানে পরিবর্তিত লুসিফেরেস প্রতিবেদকের অভিব্যক্তি উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত হয়নি, প্রত্যক্ষ দমনকে নিশ্চিত করে। এমআইআর -9 দ্বারা চিত্র HF1 (চিত্র 3 এফ)। তারপরে আমরা এমবি সেল লাইনে HES1 প্রোটিন স্তরের এমআরআর -9 ওভাররেসপ্রেসের প্রভাব পরীক্ষা করলাম। নিম্ন এন্ডোজেনাস এমআইআর -9 এক্সপ্রেশন (চিত্র 3 জি) এর ইকটোপিক পুনরুদ্ধার কার্যকরভাবে এইচইএস 1 প্রোটিন স্তরের 30% হ্রাস (চিত্র 3 এইচ এবং পরিপূরক চিত্র এস 2 ই) কার্যকরভাবে কার্যকর করেছিল। এই ফলাফলটি দুটি অতিরিক্ত এমবি সেল লাইনে (পরিপূরক চিত্র এস 2 ই) নিশ্চিত করা হয়েছিল। সামগ্রিকভাবে, এই অনুসন্ধানগুলি দেখায় যে এমআইআর -9 এইচইএস 1 এক্সপ্রেশনকে নিয়ন্ত্রণ করে এবং এমইএস কোষগুলিতে এমইআর -9 এর কার্যকরী লক্ষ্য হিসাবে HES1 কে পরামর্শ দেয়।

এমবিআর কোষগুলিতে এমআইআর -9 পুনরুদ্ধার কোষ চক্রের গ্রেপ্তারকে প্ররোচিত করে এবং ক্লোনাল বৃদ্ধিকে বাধা দেয়

এইচইএস 1 কোষ চক্রের ইনহিবিটারগুলির ট্রান্সক্রিপশনাল দমনগুলির মাধ্যমে টিউমার কোষের বৃদ্ধি নিয়ন্ত্রণ করে যেমন পি 21 (ওয়েফ 1 / সিপ 1), যা কোষ চক্র নিয়ন্ত্রণের কেন্দ্রস্থল এবং এমবি (চিত্র 4 এ; কাবস এট আল সহ মানব ক্যান্সারের বিশাল সংখ্যাগরিষ্ঠে পরিবর্তিত হয়), 2002; মুরতা এট আল, 2005; মনোহান এট আল, 2009)। আমরা অনুমান করেছিলাম যে এইচইএস 1 এমআইআর -9 পুনরুদ্ধারকে দমন করার দ্বারা এম 21 কোষগুলিতে কোষ চক্রের অগ্রগতির অনকোজেনিক সংযোজনকে সীমাবদ্ধ করতে পারে পি 21-র আপগ্রেশন প্রচার করে। এই সম্ভাবনাটি পরীক্ষা করার জন্য, আমরা এমআইআর -9 পুনরুদ্ধারের পরে সেল চক্র বিতরণ, পি 21 এক্সপ্রেশন পরিবর্তন এবং এমবি কোষের ক্লোনালি বৃদ্ধি করার ক্ষমতা পরিমাপ করেছি। প্রি -এমআইআর -9 এর মাধ্যমে এমবি কোষ স্থানান্তরিত হয়েছিল নিয়ন্ত্রণ-স্থানান্তরিত কক্ষগুলির তুলনায় সেলচক্র বিতরণে ধারাবাহিক পরিবর্তন দেখায় showed আমরা এস-ধাপে কোষের সংখ্যা হ্রাস এবং জি 1 পর্বে কোষের বৃদ্ধি লক্ষ্য করেছিলাম, কোষ চক্র গ্রেফতারের সূচক। আনুষাঙ্গিকভাবে এসইআরএনএ-মধ্যস্থতা নির্ধারণ করে এইচইএস 1 এর এস-ফেজের কোষের সংখ্যা হ্রাস পেয়েছে, যার ফলে এমআইআর -9 ওভাররিপ্রেসেশনের প্রভাব (চিত্র 4 বি এবং সি) ফিনোকপি করে। এমআইআর -9 পুনরুদ্ধারের ফলে এমআরএনএ এবং প্রোটিন স্তরে উভয়ই পি 21 বৃদ্ধি পেয়েছিল, যখন নিয়ন্ত্রণ-স্থানান্তরিত এমবি কোষগুলির সাথে তুলনা করা হয় (চিত্র 4D)। প্রাক - মাইআর -9 এর সাথে দুটি অতিরিক্ত এমবি সেল লাইনের স্থানান্তর এই ফলাফলটিকে নিশ্চিত করেছে (পরিপূরক চিত্র S3A)। যদিও এমআইআর -9 পুনরায় প্রতিষ্ঠিত হওয়ার ফলে কোষের কার্যকারিতা, কোষ সেন্সেন্সেন্স (ডেটা দেখানো হয়নি) বা কোষের মৃত্যু (পরিপূরক চিত্র এস 3 বি এবং সি) প্রভাবিত হয়নি, এটি কলোনিগুলি গঠনের কোষের ক্ষমতা হ্রাস করেছে (চিত্র 4E), এবং এটি হ্রাস পেয়েছে নিউরোনাল গোলকের আকার এবং চিত্র (চিত্র 4 এফ)। একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি এমবি কোষের বৃদ্ধির বিপরীতে এমআইআর -9 পুনরুদ্ধারের সম্ভাব্য সুবিধাটি হাইলাইট করে।

Image

এমআইআর -9 পুনরুদ্ধার এইচইএস 1 প্রতিক্রিয়াশীল জিন পি 21 সিপ 1 আপগ্রেট করে এবং এমবি কোষগুলির ক্লোনাল বৃদ্ধি ব্যাহত করে। ( ) কার্টুন কোষ চক্র সম্পর্কিত এমআর -9 ডাউন স্ট্রিম প্রতিক্রিয়াশীল জিন এবং তাদের ক্রিয়াকলাপগুলির একটি ওভারভিউ চিত্রিত করে। ( বি, সি ) প্রি - এমআইআর -9 বা নিয়ন্ত্রণের সাথে এবং এইচইএস 1 সিআরএনএ বা সিআরএনএ স্ক্র্যাম্বলড কন্ট্রোলের মাধ্যমে স্থানান্তরিত হওয়ার পরে সূচিত এমবি সেল লাইনের 72 ঘন্টা এর জন্য কোষ চক্র বিতরণের সাইকোমেট্রিক বিশ্লেষণ। ( ডি ) প্রি-এমআইআর 9 সূচিত এমবি সেল লাইনে পি 21 এমআরএনএ (উপরের প্যানেল) এবং প্রোটিন (লোয়ার প্যানেল) এক্সপ্রেশনের মধ্যস্থতা আপগ্রেশন। ( ) কলোনি গঠন এবং ( এফ ) গোলাকার গঠনের বিশ্লেষণটি মানব এমবি ডিএওওয়াই কোষগুলির প্রাক - এমআইআর -9 বা 6 দিনের জন্য নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে চিকিত্সা করা হয়। লোয়ার প্যানেল: প্রতিনিধি ছবি (* পি <0.05, ** পি <0.01 শিক্ষার্থীদের টি-টেস্ট অনুসারে))

পূর্ণ আকারের চিত্র

এমবি কোষগুলিতে এমআইআর -9 পুনঃ প্রতিষ্ঠা নিউরাল পার্থক্যকে উত্সাহ দেয়

অন্তঃসত্ত্বা এইচইএস 1 এর অন্তর্ভুক্তি নিউরোনাল পার্থক্যকে বাধা দেয় (কেগেইমা এবং ওহটসুকা, 1999; ওহটসুকা এট আল, 1999), যখন এইচইএস 1 নকআউট বা মিউটেশন ভিভোতে নিউরোনাল পার্থক্যের দিকে পরিচালিত করে (চিত্র 5 এ) (ইশিবাশি এট আল, 1995; টোমিটা এট আল, 1996) । নিউরোনাল ডিফারেনশনে HES1 এর গুরুত্বপূর্ণ নিয়ন্ত্রক ক্রিয়াকলাপটি দেওয়া (কাবোস এট আল, 2002; সানগ এট ​​আল, ২০০৮), আমরা হাইপেসে অনুমান করেছিলাম যে এইচইএস 1 এর এমআইআর -9-মধ্যস্থতা দমন এমবি কোষের পার্থক্যকে ট্রিগার করতে পারে। এই সম্ভাবনাটি পরীক্ষা করার জন্য, আমরা এমবি সেলের পার্থক্যে এমআরআর -9 পুনরুদ্ধারের প্রভাবটি মূল্যায়ন করেছি। ক্যানোনিকাল নিউরাল ডিফারেনসিফিকেশন মার্কারগুলির একটি প্যানেলের এমআরএনএ এক্সপ্রেশন স্তরটি কিউআরটি – পিসিআর দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল: নিউরোজেনিক ডিফারেনটিশন 1 (NEUROD1) (লি এট আল, 1995), নিউরোফিল্যান্ট এইচ (এনইএফএইচ) (লি এবং ক্লিভল্যান্ড, 1996), নিউরন-নির্দিষ্ট মাইক্রোটিউবুল- সম্পর্কিত প্রোটিন (এমএপি 2) (ডিনসমোর এবং সলোমন, 1991), নেস্টিন (এনইএস) (উইস এট আল, 2004), β -তুবুলিন 3 শ্রেণি তৃতীয় (টিউবিবি 3) (ক্যাটসটোস এট আল, 2003), এবং গ্লিয়াল ফাইবিলারি অ্যাসিডিক প্রোটিন (জিএফএপি) (ইঞ্জি এট আল, 2000) প্রি-এমআইআর -9 এর সাথে এমবি কোষের স্থানান্তরকরণের ফলে নিয়ন্ত্রণের সাথে তুলনা (চিত্র 5 বি) তুলনায় এমবি কোষগুলিতে নিউরাল ডিফারেনশনের মার্কেটের একটি উপসেটের এমআরএনএ এক্সপ্রেশনটি আপগ্রেশন হয়। প্রাক-এমআইআর -9-চিকিত্সা ডিএওওয়াই কোষগুলির মধ্যে, কেউ কেউ তাদের শাখা প্রশাখার মাধ্যমে একে অপরের সাথে যোগাযোগ করেছিল, এটি প্রাথমিক স্তরের পার্থক্যের প্রস্তাব দেয় (চিত্র 5 সি, উপরের প্যানেল), যখন নিয়ন্ত্রণ-চিকিত্সা কোষগুলি ফ্ল্যাট মরফোলজি ধরে রেখেছে। ইমিউনোফ্লোরিসেন্স বিশ্লেষণ প্রোটিন স্তরে নিশ্চিত হয়েছে যে এমআইআর -9 পুনরায় প্রকাশের পরে উভয় কোষের লাইনই টিউবিবি 3 এবং নেস্টিন (চিত্র 5 সি এবং পরিপূরক চিত্র এস 4 এ) এর upregulation প্রদর্শন করেছিল (ভূপীথি এট আল, 2011)। নিউরোনাল ডিফারেনশনে এমআরআর -9 -র মধ্যবর্তী প্রভাবগুলিতে HES1 দমন করার অবদান নির্ধারণ করার জন্য, আমরা নিউরোনাল পার্থক্য চিহ্নিতকারীদের এমআরএনএ প্রকাশের উপর নিঃশব্দ HES1 এর প্রভাবগুলি পরীক্ষা করেছিলাম। এমবিআর -9-র সাথে চিকিত্সা করা এমবি কোষগুলিতে যেমন পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে, এইচইএস 1-এর সিআরএনএ-মধ্যস্থতা নকআউনের ফলে নিউরোনাল ডিফারেনশন জিনের একটি পরিপূরক (পরিপূরক চিত্র এস 4 বি) আপগ্রেশন হয়েছে। একইভাবে এমআইআর -9 পুনরুদ্ধারের ফলে যে প্রভাব রয়েছে, তার মধ্যে নিউরোডি 1 , নেস্টিন এবং জিএফএপি জিনগুলি এইচইএস 1 নীরবতা দ্বারা আপগ্রেটেড করা হয়েছিল। সুতরাং, এমইআর -9- পরিচালিত নিয়ন্ত্রণটি এইচইএস 1 এর এমবি সেল ডিফারেনশনে এমআর -9 ফাংশনের একটি অপরিহার্য দিক বলে মনে হয়।

Image

এমআইআর -9 পুনরুদ্ধার এমবি কোষগুলিতে প্রো নিউরাল ডিফারেনশন জিনগুলির প্যানেলের অভিব্যক্তি বাড়ানোর মধ্যস্থতা করে। ( ) কার্টুন নিউরোনাল পার্থক্য সম্পর্কিত মিআর -9 / এইচএসইএস 1 স্ট্রিম রেসপন্সিক জিনের একটি ওভারভিউ চিত্রিত করে। ( ) প্রি-এমআইআর -9 বা নিয়ন্ত্রণের সাথে ট্রান্সফেকশন অনুসরণ করে QRT trans PCR 72 ঘন্টা দ্বারা নির্ধারিত উল্লিখিত প্রো-নিউরাল পার্থক্য জিনগুলির আপেক্ষিক এমআরএনএ অভিব্যক্তি। মানগুলি নিয়ন্ত্রণের তুলনায় ভাঁজ পরিবর্তনের প্রতিনিধিত্ব করে (* পি <0.1, ** পি <0.01 শিক্ষার্থীর টেস্টেস্ট অনুসারে)। ( সি ) এমআর -9 পুনর্স্থাপন এবং mi -Tubulin শ্রেণীর তৃতীয় (টিউবিবি 3) এবং নেস্টিন (এনইএস) 72 ঘন্টা পূর্ব - এমআরআর -9 বা নিয়ন্ত্রণের সাথে ট্রান্সফেকশন অনুসরণ করার পরে এমআর কোষগুলির রূপক পরিবর্তনগুলি। ( ডি ) মাইক্রিয়ারে -ভিত্তিক এক্সপ্রেশন প্রোফাইলগুলি ( আর = পিয়ারসনের সহসংযোগ সহগ) দ্বারা নির্ধারিত হিসাবে এমআরআর -9 / এইচইএস 1 এর অভিব্যক্তি সম্পর্কিত সহ 285 এমবি রোগীদের নমুনায় নির্বাচিত প্রো-নিউরাল ডিফারেনটিশন জিনের সহিত অধ্যয়ন।

পূর্ণ আকারের চিত্র

ক্লিনিক্যালি প্রাসঙ্গিক মডেলটিতে আমাদের ফলাফলগুলি বৈধ করার জন্য, 285 এমবি টিউমার (উত্তরকোট এট আল, 2012 বি) এর সেট থেকে প্রাপ্ত মাইক্রোয়ারে-ভিত্তিক এক্সপ্রেশন প্রোফাইলিং ডেটা এমআরএন -9, এইচইএস 1 এর এমআরএনএ স্তরগুলির মধ্যে সম্পর্কের জন্য অনুসন্ধান করা হয়েছিল এবং পূর্বে নির্বাচিত নিউরোনাল বিশ্লেষণ করা হয়েছিল পার্থক্য চিহ্নিতকারী। এমএপি 2, টিউবিবি 3 এবং নিউইউরডিড 1 এবং এমআর -9-2 (চিত্র 5 ডি, উপরের প্যানেল) এর এমআরএনএ এক্সপ্রেশন, এইচইএস 1 এমআরএনএ এক্সপ্রেশন (চিত্র 5 ডি, নিম্ন প্যানেল) এর সাথে সমান্তরাল সমান্তরাল মধ্যে ইতিবাচকভাবে সম্পর্কিত হতে একটি প্রবণতা পাওয়া গেছে। একই এমবি নমুনায় এমআইআর -9-1 এবং মাইআর -9-3 এর এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণেও একই রকম ফলাফল দেখা গেছে, যদিও পরিসংখ্যানগতভাবে কম গুরুত্বপূর্ণ (পরিপূরক চিত্র এস 4 সি এবং ডি)।

কোষের পার্থক্যের স্থিতিতে HES1 নিয়ন্ত্রক ক্রিয়াকলাপটি পূর্বে নিউরালপন্থী পার্থক্য জিন এমএএসএইচ 1 ( কেজাইমা এট আল, 1997) দ্বারা মধ্যস্থতার জন্য দেখানো হয়েছিল। সুতরাং, আমরা নির্ধারণ করেছি যে এমআইআর -9 পুনরুদ্ধার এমএএসএইচ 1 এর অভিব্যক্তিকে প্রভাবিত করেছে কিনা। প্রকৃতপক্ষে, এইচইএস 1 এর ডাউনগুলেশন ছাড়াও, আমরা এমএএসএইচ 1 প্রোটিন স্তরের একটি পরিমিত তবে পরিমাপযোগ্য আপগুলেশন পর্যবেক্ষণ করেছি যখন কন্ট্রোল ট্রান্সফেক্টেড কোষগুলির সাথে পরিপূরক (পরিপূরক চিত্র S4E)। এই ফলাফলগুলি প্রমাণ করে যে এমআরএল -9 এমবি কোষের বিভেদ হ্রাস করে এমবি কোষগুলিতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে এবং ক্যান্সার কোষগুলিতে পার্থক্য প্রোগ্রাম পুনরায় সক্রিয় করার জন্য এমআইআর -9 পুনরুদ্ধারের সম্ভাব্য ব্যবহারকে হাইলাইট করে।

এমআইআর -9 এবং এইচইএস 1 এক্সপ্রেশন পেডিয়াট্রিক এমবির ক্লিনিকোপ্যাথলজিকাল বৈশিষ্ট্যগুলির সাথে জড়িত

পরিশেষে, আমরা পেডিয়াট্রিক এমবির ক্লিনিকোপ্যাথলজিকাল বৈশিষ্ট্যগুলির সাথে এমআইআর -9 এবং এইচইএস 1 এক্সপ্রেশনটির সংযোগ তদন্ত করেছি। এমবি এর তিনটি প্রধান হিস্টোলজিকাল সাব টাইপগুলি বর্তমান ডাব্লুএইচও শ্রেণিবিন্যাস (সরকার এট আল, 2006) এর মধ্যে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে যার মধ্যে বৃহত-সেল অ্যানাপ্লেস্টিক (এলসি / এ) এমবিগুলি ক্লাসিক এবং ডেসোমপ্লাস্টিক সাব টাইপের (লিওনার্ড এট আল, 2001; ভন হফ এট আল, 2010)। এমবি হিস্টোপ্যাথলজিকাল সাব টাইপগুলির সাথে এমআইআর -9 এক্সপ্রেশনের সম্পর্ক নির্ধারণ করার জন্য, আমরা হিস্টোলজিকাল বৈশিষ্ট্যগুলি সম্পর্কে উপলভ্য তথ্য সহ এমবি প্রাথমিক নমুনার একটি সেট বিশ্লেষণ করেছি। মারাত্মকভাবে, এলসি / এ এমবি নমুনাগুলি অন্যান্য ভেরিয়েন্টের তুলনায় কম এমআর -9-2 এক্সপ্রেশন ধারণ করে। বিশেষত, ক্লাসিক সাব টাইপের টিউমার (চিত্র 6 এ) এর সাথে এলসি / এ এমবি তুলনা করার ক্ষেত্রে একটি পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন লক্ষ্য করা যায়। একই এমবি নমুনায় এমআইআর -9-1 এবং এমআইআর -9-3 এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন বিশ্লেষণের সাথে অ্যানাপ্লাস্টিক এমবি সাব টাইপস (পরিপূরক চিত্র এস 5 এ এবং বি) এর সাথে বিপরীতভাবে সম্পর্ক স্থাপনের অনুরূপ প্রবণতা দেখানো হয়েছে, এমআইআর এর এমির টিস্যু হ্রাসযুক্ত এক্সপ্রেশন সহ এমবি টিস্যুগুলি -9 এর আরও তীব্র প্যাথলজিকাল গ্রেড থাকে। উল্লেখযোগ্যভাবে, এলসি / এ এমবিরাও কিছুটা উচ্চতর এইচইএস 1 এক্সপ্রেশন দেখায় (চিত্র 6 বি)। তদ্ব্যতীত, ক্লিনিকাল ফলাফলের উপর এমআইআর -9 এর সম্ভাব্য প্রভাব নির্ধারণের জন্য, মাইআর -9 এক্সপ্রেশন স্তরটি বেঁচে থাকার সাথে সম্পর্কযুক্ত ছিল। 34 এমবি নমুনার জন্য রোগীর বেঁচে থাকার তথ্য পাওয়া যায়। কম এমআর -9-2 এক্সপ্রেশন সহ রোগীদের নিম্ন সামগ্রিক বেঁচে থাকার সম্ভাবনা ক্যাপলান দ্বারা প্রকাশিত – মাইয়ার বিশ্লেষণটি প্রগনোস্টিক তাত্পর্য (চিত্র 6 সি) এর দিকে দৃ strong় প্রবণতার প্রস্তাব দেয়। যদিও এটি পরিসংখ্যানগত তাত্পর্যতে পৌঁছেছে না, একই এমবি নমুনায় এমআইআর -9-1 এবং মাইআর -9-3 এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন বিশ্লেষণগুলি এমআইআর -9 এক্সপ্রেশন এবং রোগীর বেঁচে থাকার (পরিপূরক চিত্র এস 5 সি এবং ডি) মধ্যে একই রকম বিপরীত সম্পর্ক দেখিয়েছে। তদ্ব্যতীত , পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্য রেখে (চো এট আল, 2011), উচ্চ এইচইএস 1 এক্সপ্রেশন 129 এমবি নমুনার (চিত্র 6D) এর স্বতন্ত্র কোহরে নিম্ন সামগ্রিক বেঁচে থাকার সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে সম্পর্কযুক্ত। আমরা এমআইআর -9 এক্সপ্রেশন এবং মেটাস্ট্যাটিক পর্যায়ে, বয়স এবং লিঙ্গের একই এমবি নমুনার মধ্যে সম্পর্কের বিষয়টিও অনুসন্ধান করেছি তবে কোনও উল্লেখযোগ্য সম্পর্ক নেই (ডেটা দেখানো হয়নি)। একসাথে, এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে এমআইআর -9 এর কম অভিব্যক্তি (বিশেষত এমআর -9-2 ) এবং ফলস্বরূপ এইচইএস 1 এর বর্ধিত অভিব্যক্তি খারাপ এমবি ক্লিনিকাল ফলাফলের সাথে যুক্ত হতে পারে। অতএব, এমআইআর -9 এমন একটি প্রার্থী হিসাবে বিবেচিত হতে পারে যে পেডিয়াট্রিক এমবি সহ রোগীদের জন্য আরও বৈধতা অধ্যয়নের দাবিদার যে প্রতিকূল প্রাগনোসিসের পূর্বাভাস দেয়।

Image

এমআইআর -9 এবং এইচইএস 1 এর অভিব্যক্তি পেডিয়াট্রিক এমবির ক্লিনিকোপ্যাথলিজিকাল বৈশিষ্ট্যগুলির সাথে সম্পর্কিত। এমবি হিস্টোলজিকাল ভেরিয়েন্ট অনুসারে বক্স প্লটগুলি ( ) মিআর -9-2 এবং ( বি ) এইচইএস 1 এক্সপ্রেশন: ক্লাসিক ( এন = 200), (ডেসমো) ডেসমোপ্লাস্টিক ( এন = 21) এবং (এলসিএ) বড় সেল / অ্যানাপ্লাস্টিক ( এন = 30); কেন্দ্র লাইন = মাঝারি। (* পি <0.05, *** পি <0.001 শিক্ষার্থীদের টি-টেস্ট অনুযায়ী।) ( সি ) কাপলান ped পেডিয়াট্রিক এমবিগুলিতে এমআর -9-2 এক্সপ্রেশনের জন্য মাইয়ার বেঁচে থাকার বক্ররেখা। রোগীদের প্রতিটি জনগোষ্ঠীর মধ্যম অভিব্যক্তি মানের উপর ভিত্তি করে উচ্চ ( n = 17) এবং নিম্ন ( এন = 17) মাইআর -9 এক্সপ্রেশন গ্রুপে উপ-বিভক্ত করা হয়েছিল। ( ডি ) ক্যাপলান ped পেডিয়াট্রিক এমবিগুলিতে এইচইএস 1 এক্সপ্রেশনের জন্য মাঝারি বেঁচে থাকা বক্ররেখা। রোগীদের উচ্চ ( n = 13) এবং লো ( এন = 116) এইচইএস 1 এক্সপ্রেশন গ্রুপগুলিতে প্রতিটি জনগোষ্ঠীর মধ্যম অভিব্যক্তি মানের উপর ভিত্তি করে উপ-বিভক্ত করা হয়েছিল। এইচইএস 1- এক্সপ্রেসিং টিউমার কম সংখ্যার কারণে অনুকূল কাট অফ নির্বাচন বোনফেরনির সংশোধনের সাথে একত্রিত হয়েছিল।

পূর্ণ আকারের চিত্র

আলোচনা

বর্তমান অধ্যয়ন প্রমাণ দেয় যে পেডিয়াট্রিক এমবিতে এমআইআর -9 উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে যখন সাধারণ ভ্রূণের সেরিবিলামের সাথে তুলনা করা হয় এবং এমআইআর -9 টি এমবি টিউমারে টিউমার-দমনকারী ভূমিকা রাখে। আমরা এই অনুসন্ধানগুলির প্রাগনীয় তাত্পর্যটি মূল্যায়ন করেছি, কারণ এমবি -তে এমআরআর -9 এর কার্যকরী ভূমিকা বা ডায়াগনস্টিক ইমপ্লিকেশনগুলি আগেই সংজ্ঞায়িত হয়নি। আমাদের তদন্তে দেখা গেছে যে এমবি কোষগুলিতে এমআইআর -9 এর হ্রাসপ্রকাশটি মূলত টিউমার-নির্দিষ্ট সিপিজি প্রবর্তক হাইপারমেথিল্যানেশনের কারণে, এটি অন্যান্য ক্যান্সারের ধরণের পূর্বে নিশ্চিত হওয়া (লেহম্যান এট আল, ২০০৮; লুজাম্বিও এট আল, ২০০৮; ব্যান্ড্রেস এট আল, 2009)। এমআইআরএনএ জিনের এপিগনেটিক নিয়ন্ত্রণহীনতা বিভিন্ন ত্রুটিযুক্ত বিকাশের ক্ষেত্রে জড়িত একটি সম্ভাব্য প্রক্রিয়াটি হাইলাইট করে। পেডিয়াট্রিক এমবিতে এমআইআর -9 প্রমোটারে মেথিলিকেশনের উচ্চ ফ্রিকোয়েন্সি বিবেচনা করে আমরা এই সমীক্ষায় প্রকাশ করেছি, এমআইআর -9 জিনের প্রমোটার মেথিলিকেশন ডিগ্রি একটি সম্ভাব্য দরকারী টিউমার মার্কার হিসাবে বিবেচনা করা যেতে পারে। তদুপরি, ডিএনএ-ডেমিথিলাইটিং এজেন্টগুলির ব্যবহার ক্যান্সার রোগীদের জন্য উল্লেখযোগ্য পরিণতি ঘটাতে পারে এবং এমবি সহ নির্বাচিত রোগীদের জন্য নতুন চিকিত্সা কৌশলগুলির সম্ভাবনা খুলে দেয়।

এমবিতে, বেশ কয়েকটি মানব ক্যান্সারের মতোই, অ্যানকোজিন এমওয়াইসি-র নিয়ন্ত্রন টিউমার প্যাথোজেনেসিসের সাথে সম্পর্কিত। যদিও স্তন ক্যান্সারে এমআইআরসি-মধ্যস্থতাযুক্ত এমআইআর -9 অন্তর্ভুক্তি লক্ষ্য করা গেছে (খেও-গুডাল এবং গুডল, ২০১০), আমাদের ডেটা এমআইআর-এর এমআইসি-র একটি সম্ভাব্য প্যাথলজিকাল ফাংশনকে এমআইআর -9 এক্সপ্রেশনটির দমন জড়িত বলে প্রস্তাব করে। এই এমআইআর -9 দমন সম্ভবত এপিগনেটিক নিঃশব্দে জড়িত রয়েছে, এইভাবে বিভিন্ন টিউমার ব্যাকগ্রাউন্ডে মাইআরএনএ নেটওয়ার্কগুলির স্বতন্ত্র, প্রাসঙ্গিক-নির্ভর নিয়ন্ত্রণকে আন্ডারলাইন করে। তদুপরি, এই পর্যবেক্ষণটি এই ধারণার উপর জোর দেয় যে টিউমার-দমনকারী এমআইআরএনএগুলি যেমন এমআইআর -9 এর এমওয়াইসি-মধ্যস্থতাপূর্ণ দমন এমবিতে এমওয়াইসি টিউমারজেনিক প্রোগ্রামগুলির একটি মৌলিক উপাদান হতে পারে, বিশেষত এমবিসি উচ্চ স্তরের প্রকাশ করে সাব-গ্রুপগুলিতে। প্রকৃতপক্ষে, ডাব্লুএনটি এবং গ্রুপ 3 টি টিউমারগুলিতে এমআইআর -9 ডাউনগুলেশন সবচেয়ে বেশি প্রকাশিত হয়েছিল, যা অনকোজিন এমওয়াইসি অত্যন্ত প্রকাশ করে। বিপরীতে, গ্রুপ 4 কেস খুব কমই উচ্চ মানের স্তর এমওয়াইসি প্রকাশ করে (নর্থকোট এট আল, 2011) এবং নিউরোনাল ডিফারেনশনে জড়িত জিনগুলির একটি বেশি উপস্থাপনা দ্বারা চিহ্নিত করা হয় (চো এট আল, 2011; টেলর এট আল, 2012)। এটি কোষের পার্থক্যের প্রবর্তনের সাথে উচ্চ মাইআর -9 স্তরকে সংযুক্ত করে আমাদের অনুসন্ধান অনুসারে। মজার বিষয় হচ্ছে, গ্রুপ 4 টি টিউমারগুলি উচ্চ এনএমওয়াইসি স্তরের দ্বারা চিহ্নিত করা হয়, এমবিতে এমআর -9 এক্সপ্রেশনটির জন্য এমওয়াইসি এবং এনএমওয়াইসি-র স্বতন্ত্র কার্যকরী তাত্পর্য বোঝায়।

আমাদের পরীক্ষামূলক প্রমাণ থেকে দেখা যায় যে এমইএস - কোষগুলিতে এইচইএস 1 এমআইআর -9 -যুক্ত অনুবাদিত বাধা দেওয়ার প্রত্যক্ষ লক্ষ্যমাত্রা, নিম্ন মেরুদণ্ডের (বোনভ এট আল, ) স্তন্যপায়ী স্তন্যপায়ী HES1 (হায়রি 1) এর হোমোলজ সম্পর্কিত এমআর -9-মধ্যস্থ প্রভাব সম্পর্কে একটি সাম্প্রতিক প্রতিবেদন সংশোধন করে target 2012)। এটি অত্যন্ত তাৎপর্যপূর্ণ কারণ এইচইএস 1, প্রধান নোচচ লক্ষ্য জিনগুলির মধ্যে অন্যতম, স্তন্যপায়ী প্রাণীর স্নায়বিক প্রজনিত কোষগুলির কোষের ভাগ্য সিদ্ধান্তগুলি নিয়ন্ত্রণ করে যা থেকে এমবিগুলি উত্পন্ন হয় (সোলকিকি এট আল, 2001; পোমেরাই এট আল, 2002)। তবুও, এমবি রোগীদের নমুনার স্বতন্ত্র স্বতন্ত্র সেটগুলিতে এমআইআর -9 এবং এইচইএস 1 এক্সপ্রেশনের মধ্যে বিপরীত সম্পর্কটি ক্লিনিকভাবে প্রাসঙ্গিক। এমআইআর -9 এবং এইচইএস 1 এক্সপ্রেশনটির একটি উপগোষ্ঠী-বিশ্লেষণ অ-ডাব্লুএনটি এমবিগুলিতে নেতিবাচক পারস্পরিক সম্পর্ক প্রকাশ করেছে। অন্যদিকে, ডাব্লুএনটি-টাইপ এমবিগুলি এমআইআর -9 এক্সপ্রেশনটির পরিবর্তে বৃদ্ধি দেখিয়েছে। এটি ইঙ্গিত করতে পারে যে মাইআর -9 এর অনুবাদমূলক বাধা নিষেধের উপর একটি উপ-গোষ্ঠী-নির্দিষ্ট প্রভাব রয়েছে এবং ডাব্লুএনটি সাবগ্রুপের মধ্যে প্রস্তাবিত স্বতন্ত্র মাইক্রোআরএনএ স্বাক্ষরের অনুরূপ ডাব্লুএনটি এমবিগুলিতে বিভিন্ন লক্ষ্যগুলি নিয়ন্ত্রণ করে। তবুও, এই ভবিষ্যদ্বাণীটি নিশ্চিত করার জন্য ডাব্লুএনটি টিউমারগুলির একটি বৃহত দলটির বিশ্লেষণ প্রয়োজন।

আমাদের তদন্তে দেখা গেছে যে এমআইআর -9 এক্সপ্রেশন পুনরুদ্ধার এমবি কোষগুলিতে জি 1 / এস কোষ চক্রের গ্রেফতারের দিকে পরিচালিত করে এবং এমআইআর -9 এর টিউমার-দমনকারী ভূমিকাটি প্রাথমিকভাবে এইচইএস 1 বিধিবিধানের মাধ্যমে মধ্যস্থতা করা হয়। এমআইআর -9 পুনরুদ্ধারটি জি 1 / এস পর্যায়ে কোষগুলি আটকে রেখে এবং এইচইএস 1 ইনহিবিশন এবং পি 21 ইনডাকশন এর মাধ্যমে কোষ চক্রের অগ্রগতি রোধ করে এমবি কোষের বৃদ্ধি হ্রাস করতে পারে। এমইআর -9- এইচইএস 1 -এর সংযোজনমূলক বাধা এছাড়াও প্রাথমিক স্নায়বিক পার্থক্য চিহ্নিতকারী টিউবিবি 3, নিউরাল-প্রসূন চিহ্নিতকারী নেস্টিন, এবং অ্যাস্ট্রোসাইটিক পার্থক্য চিহ্নিতকারী জিএফএপি সহ স্বতন্ত্র নিউরোনাল ডিফারেন্সেশন মার্কার প্রকাশকে উত্সাহিত করেছিল, যা কম আক্রমনাত্মক এমবি এবং অ্যান্টিক্যান্সারের সাথে উচ্চতর সংবেদনশীলতার সাথে যুক্ত হয়েছে ড্রাগস (সাদাতোমো এট আল, 1996; সন এট আল, 2003)। প্রকৃতপক্ষে, আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে এমআইআর -9 দুর্বল পার্থক্যযুক্ত এমবি কোষগুলিতে হ্রাস পেয়েছে, যেখানে এটি সাধারণত ভ্রূণের সেরিবেলামে প্রকাশিত হয় যা থেকে এমবি টিউমার উত্থিত হয়। অতএব, এমআইআর -9 পুনরুদ্ধারটি নিউরোজেনিক বিভাজন প্রোগ্রামটি পুনরায় প্রতিষ্ঠিত করতে পারে এবং এইচইএস 1 এর দমন মাধ্যমে এমবি টিউমোরিজেনিক ফিনোটাইপ হ্রাস করতে পারে।

প্রগনোস্টিক ফ্যাক্টর হিসাবে এমআইআর -9 এর ভূমিকা সম্পর্কে সম্প্রতি বিভিন্ন টিউমারগুলিতে বর্ণনা করা হয়েছে, যেমন তীব্র লিম্ফোসাইটিক লিউকেমিয়া (অ্যাগ্রির এট আল, ২০০৯), তীব্র মাইলয়েড লিউকেমিয়া (মার্কুচি এট আল, ২০০৮) এবং কোলন ক্যান্সার (স্কেটার এট আল, 2008)। প্রাথমিক টিউমার ডেটা সেটগুলির বিশ্লেষণের ভিত্তিতে, বর্তমান সমীক্ষাটি পরামর্শ দেয় যে এমআর -9 এমবি রোগীর ফলাফলের ভবিষ্যদ্বাণী হিসাবেও কার্যকর হতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, এমআর -9 এর নিম্ন স্তরের টিউমারযুক্ত এমবি রোগীরা (এবং একই সাথে উচ্চতর এইচইএস 1 ) গরিব বেঁচে থাকার হার দেখায়। এটি সম্প্রতি প্রকাশিত প্রতিবেদনের সাথে একমত যে উচ্চ HES1 এক্সপ্রেশন স্তর দুর্বল এমবি প্রাগনোসিসের সাথে জড়িত (হাল্লাহান এট আল, 2004; ইনগ্রাম এট আল, ২০০৮)। এমবি জন্য প্রতিষ্ঠিত উচ্চ ঝুঁকি সূচকগুলির সাথে উচ্চ এইচইএস 1 / লো এমআর -9 এক্সপ্রেশনগুলির মধ্যে গুরুত্বপূর্ণ সংস্থান এমবি হিস্টোলজিতে এমআর -9 এক্সপ্রেশনটির ডায়াগনস্টিক তাত্পর্য প্রস্তাব করে।

উপসংহারে, আমরা এমআইআর-নির্দিষ্ট সিপিজি দ্বীপ হাইপারমেথিলিটিশনকে এমআইআর -9 চিহ্নিত করেছিলাম, এমবি কোষের পার্থক্য এবং কোষ চক্রের অগ্রগতির একটি জটিল নিয়ামক। গতিশীল এবং, গুরুত্বপূর্ণভাবে, ডিএনএ মিথিলিকেশনটির বিপরীতমুখী প্রকৃতি দেওয়া, আমাদের ফলাফলগুলি সূচিত করে যে এমআইআর -9 একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রগনোস্টিক অণু চিহ্নিতকারী হিসাবে কাজ করতে পারে। তদুপরি, এমআইআর -9 এক্সপ্রেশন পুনরুদ্ধার এমবি রোগীদের চিকিত্সার উন্নতিতে অবদান রাখার জন্য একটি উপন্যাসের চিকিত্সার কৌশলটি উপস্থাপন করতে পারে এবং এমবি-র প্রাণীর মডেলগুলির ভবিষ্যতের অধ্যয়নগুলি ভিভোতে এমবি টিউমার বৃদ্ধির এমআর -9-মধ্যস্থতা নিয়ন্ত্রণের মূল্যায়ন করতে হবে।

ইতিহাস পরিবর্তন কর

সম্পূরক তথ্য

পিডিএফ ফাইল

  1. 1।

    পরিপূরক চিত্র 1

  2. 2।

    পরিপূরক চিত্র 3

  3. 3।

    পরিপূরক চিত্র 5

চিত্র ফাইল

  1. 1।

    পরিপূরক চিত্র 2

  2. 2।

    পরিপূরক চিত্র 4

শব্দ নথি

  1. 1।

    পরিপূরক চিত্র কিংবদন্তী

    এই কাজটি চুক্তি প্রকাশের মানক লাইসেন্সের আওতায় প্রকাশিত হয়েছে। 12 মাস পরে কাজটি নিখরচায় উপলব্ধ হবে এবং লাইসেন্সের শর্তাদি ক্রিয়েটিভ কমন্স অ্যাট্রিবিউশন-নন-কমার্শিয়াল-শেয়ার অ্যালাইক ৩.০ অবমুক্ত লাইসেন্সে চলে যাবে।

    ব্রিটিশ জার্নাল অফ ক্যান্সারের ওয়েবসাইটে (//www.nature.com/bjc) পরিপূরক তথ্য এই কাগজটির সাথে রয়েছে