ক্যান্সার কোষগুলির সংরক্ষিত বৈশিষ্ট্যগুলি হ্যামলেট-প্ররোচিত মৃত্যুর প্রতি তাদের সংবেদনশীলতা সংজ্ঞায়িত করে; সি-মাইক এবং গ্লাইকোলাইসিস | oncogene

ক্যান্সার কোষগুলির সংরক্ষিত বৈশিষ্ট্যগুলি হ্যামলেট-প্ররোচিত মৃত্যুর প্রতি তাদের সংবেদনশীলতা সংজ্ঞায়িত করে; সি-মাইক এবং গ্লাইকোলাইসিস | oncogene

Anonim

বিষয়

  • ক্যান্সার বিপাক
  • ক্যান্সার থেরাপি
  • কোষের মৃত্যু
  • অঙ্কোজিনের

বিমূর্ত

হ্যামলেট হ'ল টিউমারিসিডাল প্রোটিনের একটি নতুন পরিবারের প্রথম সদস্য – লিপিড কমপ্লেক্সগুলি যা ক্যান্সার কোষকে বিস্তৃতভাবে হত্যা করে, যখন স্বাস্থ্যকর, ডিফারেনটেটেড কোষকে ছাড়ায়। অনেকগুলি এবং বিভিন্ন টিউমার কোষের প্রকারগুলি মারাত্মক প্রভাবের প্রতি সংবেদনশীল, যা পরামর্শ দেয় যে হ্যামলেট ক্যান্সার কোষগুলিতে সংরক্ষিত মৃত্যুর পথগুলি চিহ্নিত করে এবং সক্রিয় করে। এখানে, আমরা ক্যান্সার কোষ এবং স্বাস্থ্যকর কোষগুলির মধ্যে সংবেদনশীলতার পার্থক্যের জন্য আণবিক ভিত্তিতে তদন্ত করেছি। ছোট-হেয়ারপিন আরএনএ (shRNA) ইনহিবিশন, প্রোটমিক এবং বিপাক প্রযুক্তিগুলির সংমিশ্রণটি ব্যবহার করে আমরা সি-মাইক অনকোজিনকে হ্যামলেট সংবেদনশীলতার একটি প্রয়োজনীয় নির্ধারক হিসাবে চিহ্নিত করেছি। সি-মাইকের এক্সপ্রেশন লেভেল বর্ধিত হ্যামলেটের প্রতি সংবেদনশীলতা এবং সি-মাইকের shRNA নকআডাউন মারাত্মক প্রতিক্রিয়াকে দমন করেছে, প্রস্তাবিত যে সি-মাইকের সাথে অনকোজেনিক রূপান্তর একটি হ্যামলেট সংবেদনশীল ফিনোটাইপ তৈরি করে। তদ্ব্যতীত, HAMLET সংবেদনশীলতা টিউমার কোষের গ্লাইকোলাইটিক অবস্থা দ্বারা সংশোধন করা হয়েছিল। গ্লুকোজ বঞ্চনা টিউমার কোষকে সংশ্লেষিত করে হ্যামলেট-প্রেরিত কোষের মৃত্যুতে এবং shRNA স্ক্রিনে, হেক্সোকিনেজ 1 (এইচকে 1), 6-ফসফ্রফট্রো-2-কিনাস / ফ্রুকটোজ-2, 6-বিফোস্প্যাটেস 1 এবং হাইপোক্সিয়া-ইনডুসিভ ফ্যাক্টর 1-সংশোধিত হ্যামলেট সংবেদনশীলতা। এইচকে 1 টি HAMLET কে protein 8000 টার্গেটযুক্ত প্রোটিন অ্যারে বেঁধে দেখানো হয়েছিল, এবং টিউমার কোষের মৃত্যুর আকারের লক্ষণগুলির আগে HKLET চিকিত্সার 15 মিনিটের মধ্যে এইচকে ক্রিয়াকলাপ হ্রাস পেয়েছিল। সমান্তরালভাবে, HAMLET কার্সিনোমা কোষগুলিতে দ্রুত বিপাকীয় পক্ষাঘাতের সূত্রপাত করেছিল। টিউমার কোষগুলিতে ইতোমধ্যে 15 মিনিটের পরে অলাইক অ্যাসিড এবং এর ডেরাইভেটিভগুলি প্রচুর পরিমাণে ধারণ করে। ফলাফলগুলি হ্যামলেটকে একটি উপন্যাস-ক্যান্সার বিরোধী এজেন্ট হিসাবে সনাক্ত করে যা ক্যান্সার কোষগুলির অনকোজিন আসক্তি বা ওয়ারবার্গের প্রভাব হিসাবে মিলিত বৈশিষ্ট্যগুলি ব্যবহার করে টিউমার কোষগুলিকে মেরে ফেলে।

ভূমিকা

অনকোজেনিক রূপান্তরের আণবিক জটিলতা সত্ত্বেও ক্যান্সার কোষগুলি ঘন ঘন 'অনকোজিন আসক্তি'তে ভোগে এবং একক অনকোজিনের ব্যত্যয় হয় অনকোজিনেসকে বিপরীত করতে পারে বা মারাত্মক হতে পারে (ওয়েইনস্টেইন এবং জো, ২০০৮)। সি-মাইক অনকোজিন একটি ক্লাসিক উদাহরণ (ফেলশার এবং বিশপ, 1999) এবং সমস্ত মানব ক্যান্সারের কমপক্ষে 40% (ড্যাং এট আল।, ২০০৯) এ নিয়ন্ত্রিত। সি-মাইকের বিস্তৃত রূপান্তরকারী প্রভাবটি সমস্ত পরিচিত জিনের কমপক্ষে 30% প্রবর্তককে বাঁধানোর ক্ষমতা দ্বারা ব্যাখ্যা করা হয়েছে (ডাং এট আল।, ২০০৯), এবং ট্রান্সজেনিক ইঁদুরের মধ্যে, সি-মাইক ওভারপ্রেসেশন অ্যাওপটোসিস প্রতিরোধের সাথে মিলিত হয়েছে অগ্ন্যাশয় ক্যান্সার গঠনের গাড়ি চালানোর জন্য যথেষ্ট (পেলেঙ্গারিস এট আল।, 2002)। অতি সম্প্রতি, সি-মাইকের প্রতিরোধের জন্য ক্যান্সার বৃদ্ধি বন্ধ করতে এবং টিস্যু মেরামত ও কার্যকরী ফিনোটাইপকে ফিরিয়ে আনার প্রস্তাব দেওয়া হয়েছিল (সউসেক এট আল।, ২০০৮)। বিপরীতে, স্বাস্থ্যকর কোষগুলি প্রোগ্রামেড কোষের মৃত্যু, বৃদ্ধির বিরোধী সংকেত এবং অন্যান্য আণবিক মিথস্ক্রিয়াগুলির প্রতি সংবেদনশীলতার কারণে একটি সীমিত প্রতিরক্ষামূলক সম্ভাবনা বজায় রাখে যা দীর্ঘায়ুতা সীমাবদ্ধ করে এবং স্বাভাবিক টিস্যু হোমিওস্টেসিস বজায় রাখে (হানাহান এবং ওয়েইনবার্গ, ২০০০, ২০১১)।

অনকোজিন ক্রিয়াকলাপ এছাড়াও গ্লাইকোলিটিক যন্ত্রপাতি (Hsu and Sabatini, 2008) পরিবর্তনের কারণ হতে পারে এবং ক্যান্সার কোষগুলি গ্লাইকোলাইসিসের উপর অত্যন্ত নির্ভরশীল হয় (মথুপালা এট আল।, 1997)। গ্লুকোজ প্রথমে হেক্সোকিনেস 1 এবং 2 (এইচকে 1 এবং এইচ কে 2) (উইলসন, 2003) দ্বারা কোষের অভ্যন্তরে আটকে যায় এবং তারপরে আরও পাইরেভেটে রূপান্তরিত হয়। স্বাস্থ্যকর কোষগুলির বিপরীতে, ক্যান্সার কোষগুলি অক্সিজেনের উপস্থিতিতে এমনকি ল্যাকেটে রূপান্তর করতে পিরাওয়েট চালনা করে, এটি ওয়ারবর্গ এফেক্ট হিসাবে পরিচিত একটি প্রক্রিয়া (ওয়ারবার্গ, 1956)। সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে বেশিরভাগ ক্যান্সার কোষে অক্সিডেটিভ ফসফোরিলেশন কার্যকরী হয় (ভ্যান্ডার হেইডেন এট আল।, ২০০৯) এবং প্রস্তাবিত হয়েছে যে ওয়ারবর্গের প্রভাব পাইরুভেট কিনেস আইসোফর্ম এম 2 (পিকেএম 2) এর প্রকাশকে প্রতিফলিত করতে পারে (ক্রিস্টোফট এট আল। ২০০৮), যা পাইফ্রয়েটে ফসফেনলপিপ্রাইভেটের ডিপোসফোরিলেশন অনুঘটক করে এবং গ্লাইকোলিটিক ক্রমের মধ্যে নেট এটিপি উত্পাদনের জন্য দায়ী। স্বাস্থ্যকর পার্থক্যযুক্ত কোষগুলির বিপরীতে, ভ্রূণ কোষ এবং বেশিরভাগ ক্যান্সার কোষগুলি এম 2 আইসোফর্মটি প্রকাশ করে (মাজুরেক এট আল। 2005) এবং কিছু টিউমারে এম 2 দ্বারা এম 2 প্রতিস্থাপন ওয়ার্ববার্গের প্রভাবকে উল্টে দেয় এবং টিউমারিজিনিকটি হ্রাস করে (ক্রিস্টোফট এট আল।) 2008)। পিকেএম 2 ছাড়াও সি-মাইকের নির্দিষ্ট টিউমার কোষগুলিতে বিপাক পুনর্নির্মাণে মৌলিক ভূমিকা রয়েছে এবং এইচকে 2 , পিকেএম 1 এবং এলডিএইচএর মতো সরাসরি সক্রিয় জিনগুলির মাধ্যমে বায়বীয় গ্লাইকোলাইসিস বাড়ানো দেখানো হয়েছে (শিম এট আল।, 1997; ডাং এট আল ।, 2009)। ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর হাইপোক্সিয়া-ইনডুসিবল ফ্যাক্টর 1 (এইচআইএফ 1) গ্লুকোজ ট্রান্সপোর্টারস, এইচকে এবং ফসফো-ফ্রুকটোকিনেসেস (পিএফকে) (ডেনকো, ২০০৮) এর এক্সপ্রেশন বাড়িয়ে গ্লাইকোলাইসিসকে নিয়ন্ত্রণ করে।

হ্যামলেট আংশিকভাবে প্রকাশিত α-ল্যাক্টালবুমিন এবং ওলেইক অ্যাসিডের একটি জটিল, যা ক্যান্সার কোষ এবং অপরিণত কোষকে অগ্রাধিকার দিয়ে হত্যা করে (সানবার্গ এট আল। 2003)) বিস্তৃত টিউমারিসিডাল ক্রিয়াকলাপে লিউকেমিয়া কোষ, কার্সিনোমা কোষ এবং গ্লিওমা কোষ অন্তর্ভুক্ত রয়েছে, যেখানে স্বাস্থ্যকর, পৃথক পৃথক কোষগুলি হ্যামলেট চ্যালেঞ্জ থেকে বেঁচে থাকে (ফিশার এট আল।, 2004)। হ্যামলেটটি সংরক্ষণ করে বেঁচে থাকা অত্যন্ত রক্ষিত ব্যবস্থাগুলি লক্ষ্য করে যা ক্যান্সার কোষগুলির জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। এই সিলেকটিভিটি ভিভোতে হিউম্যান গ্লিওব্লাস্টোমা জেনোগ্রাফ্ট মডেল এবং মুরিন ব্লাডার ক্যান্সারের মডেল (ফিশার এট আল।, 2004; মোসবার্গ এট আল।, ২০১০) এ নিশ্চিত হয়েছে। চামড়া পেপিলোমাস এবং মূত্রাশয় ক্যান্সারের ক্লিনিকাল গবেষণায় (গুস্তাফসন এট আল।, 2004; মোসবার্গ এট আল।, 2007) হ্যামলেট টিউমারিসিডাল কার্যকলাপ সীমিত পার্শ্ব প্রতিক্রিয়া সহ দেখিয়েছিল।

এই গবেষণায় ক্যান্সার কোষগুলিতে হ্যামলেট সংবেদনশীলতার আণবিক ভিত্তিতে তদন্ত করা হয়েছে, প্রতিলিপি, প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া এবং বিপাকের বৈশিষ্ট্যগুলি সনাক্ত করতে স্ক্রিনিংয়ের কৌশলগুলি ব্যবহার করে যা হ্যামলেট এক্সপোজারের পরে বেঁচে থাকার পরিবর্তন করে। আমরা দেখাই যে HAMLET এর সংবেদনশীলতা সি-মাইক এবং গ্লাইকোলাইসিসের উপর নির্ভরশীল এবং গ্লাইকোলিটিক এনজাইম এইচকে 1 কে হ্যামলেটের সম্ভাব্য প্রত্যক্ষ লক্ষ্য হিসাবে চিহ্নিত করেছে। ফলাফলগুলি আরও ইঙ্গিত দেয় যে হ্যামলেট ক্যান্সার কোষ বিপাককে পরিবর্তন করে এবং এটি গ্লাইকোলাইসিসকে ব্যাহত করতে পারে, যা ওয়ারবার্গের প্রভাবের কারণে ক্যান্সারের কোষগুলিতে পরিবর্তিত হয়।

ফলাফল

একটি shRNA স্ক্রিন সি-মাইক এবং গ্লাইকোলিটিক-সম্পর্কিত প্রোটিনকে হ্যামলেট সংবেদনশীলতার সংশোধক হিসাবে চিহ্নিত করে

হ্যামলেট সংবেদনশীলতার জন্য জিনের গুরুত্বপূর্ণ একটি নিরপেক্ষ পর্যালোচনা পেতে, আমরা আরএনএ হস্তক্ষেপ বারকোড স্ক্রিনিং প্রযুক্তি ব্যবহার করেছি (ব্রুমেলক্যাম্প এবং বার্নার্ডস, ২০০৩; সিলভা এট আল, ২০০ 2005, ২০০৮)। বারকোড স্ক্রিনগুলি একটি shRNA ভেক্টর লাইব্রেরি (চিত্র 1 এ) সংক্রামিত সংখ্যক কোষে প্রতিটি ছোট-হেয়ারপিন আরএনএ (shRNA) ভেক্টরের আপেক্ষিক প্রাচুর্য অনুসরণ করতে ডিএনএ মাইক্রোয়ারে ব্যবহার করে। রেট্রোভাইরাল সংক্রমণ ব্যবহার করে, আমরা 4603 টি এসআরএনএগুলির সংকলন চালু করেছি যাতে ক্যান্সার সম্পর্কিত 1650 ক্যান্সার সম্পর্কিত জিনকে লক্ষ্য করে ডিজাইন করা হয়েছিল (সিলভা এট অ্যাল।, 2005) আরএএনএর হস্তক্ষেপ দ্বারা A549 ফুসফুস কার্সিনোমা কোষগুলিতে দমন করার জন্য, যা হ্যামলেট সংবেদনশীল হিসাবে পরিচিত। সংক্রামিত কোষগুলিকে তিনটি পুলে বিভক্ত করা হয়েছিল, যার মধ্যে একটি চিকিত্সাবিহীন অবস্থায় রেখে দেওয়া হয়েছিল এবং এটি একটি রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল, অন্য দুটি হ্যামলেটের নিম্ন (7 μ এম) এবং উচ্চ (35 μ এম) ঘনত্বের সংস্পর্শে ছিল। হ্যামলেট চিকিত্সার 2 ঘন্টা পরে, আমরা পিসিআর পরিবর্ধনের মাধ্যমে shRNA ক্যাসেটগুলি উদ্ধার করেছি এবং পূর্বে বর্ণিত হিসাবে ডিএনএ মাইক্রোয়ারে সংকরকরণের মাধ্যমে তাদের তুলনামূলক প্রাচুর্য বিশ্লেষণ করেছি (জেন্ডার এট আল।, ২০০৮)।

Image

একটি shRNA বারকোড স্ক্রিন সি-মাইক এবং বিপাকীয় প্রোটিনকে হ্যামলেট সংবেদনশীলতার নির্ধারক হিসাবে চিহ্নিত করে। ( ) shRNA পর্দার কর্মপ্রবাহ। A549 কোষগুলি 1650 ক্যান্সার সম্পর্কিত জিনকে লক্ষ্য করে বারকোডযুক্ত shRNA- এর একটি লাইব্রেরিতে সংক্রামিত হয়েছিল। 2 ঘন্টা HAMLET এক্সপোজারের পরে, বারকোডগুলি পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল, Cy3 / Cy5 দ্বারা প্রসারিত এবং লেবেলযুক্ত ছিল এবং প্রতিটি shRNA এর আপেক্ষিক প্রাচুর্যতা মাইক্রোয়ারে দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। ( ) এমএ (লগ-তীব্রতা অনুপাত ( এম- ভ্যালু) বনাম লগ-তীব্রতা গড় ( এ- ভ্যালু)) নিয়ন্ত্রণের নমুনাগুলিতে (সাই 3) বনাম হ্যামলেট (35) এর প্লটগুলিতে সংখ্যক হেয়ারপিনগুলি সমৃদ্ধ করা হয়েছিল μ এম) নমুনা (সাই 5)। ( সি, ডি ) এইচকে 1 কে লক্ষ্য করে shRNA গুলি এবং বিপাক-নিয়ন্ত্রক জিনগুলি পিএফকেএফবি 1 , এইচআইএফ 1 c এবং সি-মাইক হ্যামলেট সংবেদনশীলতা উল্লেখযোগ্যভাবে সংশোধন করে। চিত্রটি প্রতিটি জিনের জন্য পর্যবেক্ষণ করা সর্বাধিক স্কোর দেখায়। ( e, f ) shRNA স্ক্রিন থেকে সমস্ত ধনাত্মক হিটযুক্ত জিন তালিকার ইতিবাচক shRNA গুলি দ্বারা লক্ষ্যযুক্ত সাধারণ পথগুলি সনাক্ত করতে ক্যানোনিকাল প্যাথওয়ে সংগ্রহটি ব্যবহার করে জিন সেট সমৃদ্ধ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। গ্লাইকোলাইসিস-সম্পর্কিত পথগুলির সাথে একত্রে রাস পথটি সর্বাধিক স্বাভাবিকীকরণ সমৃদ্ধকরণ স্কোর (এনইএস) ছিল।

পূর্ণ আকারের চিত্র

এইচএমএলএটি-র সংখ্যক সংখ্যক shRNA ভেক্টর সমৃদ্ধ বা হ্রাস পেয়েছে; 43 ইনহিবিটরি এবং 44 সংবেদনশীল shRNAs উচ্চ এবং নিম্ন-ডোজ উভয় চিকিত্সা গ্রুপে বা 0.5% এর নিরঙ্কুশ স্কোরটি দেখায় বা কোনও গ্রুপে> 2 এর পরম স্কোর দেখায় (চিত্র 1 বি এবং পরিপূরক টেবিল এস 1)। চিহ্নিত জিনগুলিতে সি-মাইক এবং গ্লাইকোলাইসিস সম্পর্কিত প্রোটিনের মতো অনকোজিন অন্তর্ভুক্ত ছিল। এইচকে 1 এবং এইচআইএফ 1 এর বিপরীতে shRNA গুলি কোষগুলিকে হ্যামলেটে সংবেদনশীল করেছিল (চিত্র 1c এবং d), যা এইচকে 1 এবং এইচআইএফ 1α এক্সপ্রেশন বাড়িয়েছে হ্যামলেটের প্রতিরোধী একটি ফেনোটাইপকে চালিত করে। বিপরীতে, shRNA 6-ফসফ্রফ্রাক্টো-2-কিনেজে / ফ্রুক্টোজ-2, 6-বিফোস্প্যাটেস (পিএফকেএফবি 1) এবং সি-মাইককে লক্ষ্য করে কোষগুলি উদ্ধার করেছে (চিত্র 1 সি এবং ডি)। হ্যামলেট দ্বারা সমৃদ্ধ জৈবিক পথগুলি ক্যানোনিকাল পাথওয়েজ জিন সেট সংগ্রহ ব্যবহার করে জিন সেট সমৃদ্ধ বিশ্লেষণ (জিএসইএ) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। GSEA অ্যালগরিদম এই জাতীয় আইটেমগুলির বৃহত্তর স্থানের তালিকার মধ্যে আইটেমগুলির একটি সেট সমৃদ্ধ করার জন্য পরীক্ষা করে। চিহ্নিত পথগুলি গ্লাইকোলাইসিসের গুরুত্বকে নিশ্চিত করেছে, কারণ চারটি গ্লাইকোলাইসিস-সম্পর্কিত পাথপথগুলি হ্যামলেট সংবেদনশীলতা (চিত্রগুলি 1 ই এবং এফ) উল্লেখযোগ্যভাবে সংশোধন করেছে। এছাড়াও, রাস-পথ, যা সি-মাইক এক্সপ্রেশন পরিচালনা করে, হ্যামলেট সংবেদনশীলতা (চিত্র 1 এফ) এর নির্ধারক হিসাবে চিহ্নিত হয়েছিল।

এইচআরএনএ স্ক্রিনটি বলেছিল যে সি-মাইকের মাধ্যমে অনকোজেনিক রূপান্তর কোষকে হ্যামলেট প্ররোচিত কোষের মৃত্যুতে সংবেদনশীল করে এবং গ্লাইকোলাইটিক যন্ত্রপাতি ক্যান্সার কোষের হ্যামলেট সংবেদনশীলতাকে প্রভাবিত করে।

সি-মাইক অনকোজিন হ্যামলেটের টিউমারিসিডাল প্রভাব নির্ধারণ করে

আমরা পরবর্তীতে পরীক্ষা করেছি যে হ্যামলেট সংবেদনশীলতা সি-মাইক এক্সপ্রেশন স্তরকে প্রতিবিম্বিত করে কিনা। মানব ফুসফুস কার্সিনোমা কোষ (A549), কিডনি কার্সিনোমা কোষ (A498) এবং আধা-পার্থক্যযুক্ত স্বাস্থ্যকর কিডনি কোষগুলি (হিউম্যান রেনাল প্রক্সিমাল নলকোষ) হ্যামলেট (21 মিমি), এবং এটিপি স্তরের পর্যবেক্ষণ (চিত্র 2 এ) দ্বারা প্রকাশিত হয়েছিল। ফুসফুস এবং কিডনি কার্সিনোমা কোষগুলিতে এটিপি স্তরের দ্রুত হ্রাস লক্ষ্য করা যায় তবে স্বাস্থ্যকর কোষগুলি 3, 6 এবং 24 ঘন্টা পরে অকার্যকর থাকে। তবে উচ্চতর হ্যামলেটের ঘনত্বগুলিতে, সেই কোষগুলিতে একটি আংশিক প্রতিক্রিয়াও দেখা গিয়েছিল (পরিপূরক চিত্র এস 1 এ)। সি-মাইকের অভিব্যক্তির পার্থক্যটি হ্যামলেট সংবেদনশীলতার পার্থক্য প্রতিফলিত করে, যেহেতু ফুসফুস এবং কিডনি কার্সিনোমা কোষগুলি স্বাস্থ্যকর কোষগুলির চেয়ে সি-মাইকের উচ্চতর প্রকাশ দেখায় (চিত্র 2 বি এবং সি)।

Image

সি-মাইক হ্যামলেট-প্ররোচিত সেল ডেথের সংবেদনশীলতা সংশোধন করে। ( ) স্বাস্থ্যকর কিডনি কোষ (এইচআরপিটিইসি), কিডনি কার্সিনোমা কোষ (এ 498) এবং ফুসফুসের কারসিনোমা কোষ (এ 549) চিকিত্সা করা হয়েছিল হ্যামলেট (২১ μ এম) এর সাথে এবং এটিপি স্তরগুলি 3, 6 এবং 24 ঘন্টা পরে পরিমাপ করা হয়েছিল। হ্যামলেট কারসিনোমা কোষগুলিতে এটিপি স্তরের হ্রাস ঘটায় তবে স্বাস্থ্যকর কোষগুলিতে নয়। এটিপি স্তরগুলি একই সময় পয়েন্টে চিকিত্সা না করা কোষের% এ দেওয়া হয়। সি-মাইক এমআরএনএ স্তরগুলির তিনটি পরীক্ষার মধ্যম + সেম ( ) কিউপিআরসি পরিমাণ নির্ধারণ। আপেক্ষিক সি-মাইক এমআরএনএ স্তরগুলি দেখানো হয় (সি-মাইক / জিএপিডিএইচ, স্বাস্থ্যকর কোষগুলির স্তরের% তে)। লোডিং নিয়ন্ত্রণ হিসাবে অ্যাক্টিন সহ দুটি পরীক্ষার মধ্যম + সেমি ( সি ) সি-মাইক ওয়েস্টার্ন ব্লট। ( d, e ) সি-মাইক shRNAs (72 এইচ) এর সাথে A549 কোষের সংক্রমণ দ্বারা সি-মাইক এক্সপ্রেশনটিকে বাধা দেওয়া QPCR (প্যানেল ডি ) এবং সি-মাইক ওয়েস্টার্ন ব্লটকে লোডিং নিয়ন্ত্রণ (প্যানেল ) হিসাবে অ্যাক্টিন দিয়ে নিশ্চিত করেছে। সম্পর্কিত সি-মাইক এমআরএনএ স্তরগুলি দেখানো হয় (সি-মাইক / জিএপিডিএইচ, সিটি (নিয়ন্ত্রণ) shRNA- ট্রান্সফেক্টেড কোষের% এর স্তরে)। দুটি পরীক্ষার মধ্যম + সেমি এনটিএফ = অ-স্থানান্তরিত। ( ) সি-মাইক shRNA- স্থানান্তরিত A549 কোষ (72 এইচ) হ্যামলেটের মারাত্মক প্রভাবের জন্য আরও প্রতিরোধী হয়ে ওঠে। হ্যামলেটের সাইটোঅক্সিক এফটিটি এইটিপি স্তরের হ্রাস বা কোষের সংখ্যায় সিটি এসআরএনএ-এর সাথে স্থানান্তরিত কোষগুলির তুলনায় 3 ঘন্টা পরে মীমাংসিত হয়েছিল। স্বীকৃত চিকিত্সা করা কোষগুলিতে% স্তরে এটিপি স্তর। ২-৩ টি পরীক্ষার মধ্যম + সেম (এটিপি) বা এক পরীক্ষায় এসডি (সেল বেঁচে থাকা) এর ট্রিপলিকেটগুলির গড় mean ( ) A549 কোষগুলি কোষ চক্র দ্বারা গ্রেপ্তার হয়েছিল সিরাম অনাহার (48 এইচ) বা ডাবল-থাইমিডিন ব্লক দ্বারা এবং হ্যামলেটের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল। ট্রিপ্যান নীল বর্জন বা এটিপি পরিমাপ ব্যবহার করার পরে 3 ঘন্টা পরে ক্যান্সার সেলের কার্যক্ষমতার মূল্যায়ন করা হয়েছিল। তিনটি পরীক্ষা-নিরীক্ষার মধ্যম + সেম।

পূর্ণ আকারের চিত্র

সি-মাইক ক্রিয়াকলাপ হ্যামলেট-প্ররোচিত কোষের মৃত্যুকে প্রভাবিত করে কিনা তা চিহ্নিত করার জন্য, A549 ফুসফুসের কার্সিনোমা কোষগুলি বাধা সি-মাইক shRNAs বা অপ্রাসঙ্গিক shRNA দ্বারা ক্ষণস্থায়ীভাবে স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং সি-মাইক এক্সপ্রেশন হ্রাস 72 ঘন্টা (চিত্রগুলি 2 ডি এবং ই) পরে নিশ্চিত করা হয়েছিল। হ্রাস করা সি-মাইক এক্সপ্রেশন সহ কোষগুলি হ্যামলেট (21, 36 to এম, 3 এইচ) এর মারাত্মক প্রভাবগুলির জন্য আরও প্রতিরোধী হয়ে উঠেছে, অপ্রাসঙ্গিক shRNA দ্বারা সংক্রমণিত কোষগুলি তাদের সংবেদনশীলতা বজায় রেখেছে, অপরিবর্তিত কোষগুলির মতো একটি এলসি 50 সহ (চিত্র 2f)। ফলাফলগুলি সূচিত করে যে সি-মাইক এক্সপ্রেশন স্তরটি ক্যান্সার কোষগুলিতে হ্যামলেট সংবেদনশীলতার সরাসরি নির্ধারক।

যেহেতু সি-মাইকের নকআউট অনেকগুলি সেল লাইনে বৃদ্ধির গ্রেফতারের কারণ ঘটায় (ওয়াটসন এট আল।, 1991), আমরা ইচ্ছাকৃতভাবে প্রবৃদ্ধি গ্রেফতারকে প্ররোচিত করে এবং হ্যামলেট সংবেদনশীলতার উপর প্রভাবটি পরীক্ষা করেছি tested A549 ফুসফুসের কার্সিনোমা কোষগুলি সিরাম প্রত্যাহার বা ডাবল-থাইমিডিন ব্লকের শিকার হয়েছিল, এবং প্রপিডিয়াম আয়োডাইড স্টেনিং (পরিপূরক চিত্র এস 1 বি) এর পরে প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা বৃদ্ধি আটকানো নিশ্চিত হয়েছিল। তবে গ্রোথ অ্যারেস্ট হ্যামলেট সংবেদনশীলতার (চিত্র 2 জি) উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তন করতে পারেনি, এটি নির্দেশ করে যে হ্যামলেট সংবেদনশীলতার উপর সি-মাইক shRNA এর প্রভাব সি-মাইক নকআউট দ্বারা প্ররোচিত কোনও সম্ভাব্য বৃদ্ধির গ্রেফতারের উপর নির্ভর করে না।

গ্লুকোজ বঞ্চনা এবং গ্লাইকোলাইসিসের প্রতিরোধকরা হ্যামলেট প্ররোচিত কোষের মৃত্যুকে বাড়িয়ে তোলে

এইচআরএনএ স্ক্রিন এবং জিএসইএ বিশ্লেষণে গ্লাইকোলাইসিস সম্পর্কিত প্রোটিনকে হ্যামলেট সংবেদনশীলতার নির্ধারক হিসাবে চিহ্নিত করেছে। গ্লাইকোলাইসিস HAMLET এর সংবেদনশীলতা সংশোধন করে কিনা তা সরাসরি সমাধান করার জন্য, A549 ফুসফুস কার্সিনোমা কোষগুলি 30 মিনিটের জন্য গ্লুকোজ থেকে বঞ্চিত ছিল, হ্যামলেটকে যুক্ত করা হয়েছিল (21 এবং 36 μ ম) এবং কোষের মৃত্যুর পরিমাণ ছিল (15 মিনিট, 1 এবং 3 ঘন্টা)। গ্লুকোজ বঞ্চনাগুলি হ্যামলেটে সংবেদনশীল কোষগুলি সংশ্লেষ করে, এটিপি স্তর এবং ট্রাইপান নীল বর্জনে নাটকীয় হ্রাস ঘটায় এবং পাশাপাশি ল্যাকটেট ডিহাইড্রোজেনেস রিলিজ বৃদ্ধি পায় এবং এই প্রভাবটি গ্লুকোজ সংযোজন দ্বারা বিপরীত হয়েছিল (চিত্র 3 এ এবং পরিপূরক চিত্রসমূহ এস 2)। এছাড়াও, গ্লুকোজ অ্যানালগ 2-ডিওক্সাইগ্লুকোজ, যা গ্লাইকোলাইসিসকে বাধা দেয়, ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে বর্ধিত হ্যামলেট বিষাক্তকরণ (চিত্র 3 বি এবং পরিপূরক চিত্র এস 2)।

Image

গ্লুকোজ বঞ্চনা এবং গ্লাইকোলাইসিস ইনহিবিশন হ্যামলেট প্ররোচিত কোষের মৃত্যুকে বাড়িয়ে তোলে। গ্লুকোজ (জি) বঞ্চনা এবং গ্লাইকোলাইটিক ইনহিবিটার 2-ডিওক্সাইগ্লুকোজ (2 ডিজি) হ্যামলেটের মারাত্মক প্রভাবগুলিকে বাড়িয়ে তোলে, যেখানে গ্লুকোজ (0.5, 2.5, 5.0 মি এম) ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে কোষগুলি উদ্ধার করে। হ্যামলেটের সাইটোঅক্সিক প্রভাবটি এটিপি স্তরগুলি পরিমাপ করে বা ট্রাইপেন ব্লু (টিবি) বর্জন দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল এবং কনফোকল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা রূপবিজ্ঞানের পরিবর্তনগুলি রেকর্ড করা হয়েছিল। ( ) গ্লুকোজ বঞ্চনা বা 2 ডিজি (2.5 মিমি) A549 কোষে HAMLET (HL, 21 μ M) এর সাইটোঅক্সিক প্রভাব বাড়িয়েছে। 2.5 মিলিয়ন এম গ্লুকোজে চিকিত্সা না করা কোষগুলিতে% স্তরে এটিপি স্তর দেওয়া হয়। 2-4 পরীক্ষার মধ্যম + সেম (1 এইচ) * পি 0.05, *** পি 0.001 (বনাম এইচএল, 5 এম এম গ্লুকোজ এটিপি এবং বনাম এইচএল, টিবিয়ের জন্য 2.5 মি এম গ্লুকোজ)। ( ) 2 ডিজি দ্বারা গ্লাইকোলাইসিস ইনহিবিশন ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে গ্লুকোজ-বঞ্চিত A549 কোষে হ্যামলেটের মারাত্মক প্রভাবগুলিকে বাড়িয়ে তোলে। চিকিত্সা করা কোষগুলিতে% স্তরে এটিপি স্তর রয়েছে। দুটি পরীক্ষা-নিরীক্ষার মধ্যম + সেমি ( ) গ্লুকোজ বঞ্চনা বর্ধমান রক্তপাত (তীর দ্বারা চিহ্নিত, খ) এবং গোলাকার, মৃত কোষগুলির সংখ্যা বৃদ্ধি পেয়েছে যা হ্যামলেটকে দৃ arrow়ভাবে দাগযুক্ত ছিল (তীর দ্বারা নির্দেশিত, ডি)। A549 কোষগুলি গ্লুকোজ থেকে বঞ্চিত ছিল, আলেক্সা ফ্লোর 568-লেবেলযুক্ত HAMLET (21 μ M, red) এর সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল, এবং মরফোলজির পরিবর্তনগুলি 3 ঘন্টা ধরে লাইভ-সেল কনফোকল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা রেকর্ড করা হয়েছিল। নিউক্লি হিউচস্ট স্টেইনিং (নীল) দিয়ে ভিজ্যুয়ালাইজড। স্কেল বার: 10 μm।

পূর্ণ আকারের চিত্র

HAMLET এর সেলুলার প্রতিক্রিয়ায় গ্লুকোজের প্রভাবগুলি আরও পরীক্ষা করতে, আলেক্সা ফ্লুর 568-লেবেলযুক্ত HAMLET হ্যাচস্টের সাথে দাগযুক্ত ক্যান্সার কোষগুলিতে যুক্ত হয়েছিল এবং রিয়েল-টাইম কনফোকল চিত্র দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল। গ্লুকোজ-বঞ্চিত কোষগুলি গ্লুকোজ খাওয়ানো কোষগুলির তুলনায় 1 ঘন্টা পরে আরও রক্তপাত দেখায় এবং 3 ঘন্টা পরে, গ্লুকোজ-বঞ্চিত কোষগুলির আরও অনেকগুলি রূপচর্চায় পরিবর্তন ঘটেছিল এবং দৃ strong় হ্যামলেট স্টেইনিং (চিত্র 3 সি) দেখিয়েছিল। তদ্ব্যতীত, 3-ব্রোমোপাইরুভেট, যা গ্লাইকোলাইসিস এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল এটিপি উত্পাদনকে বাধা দেয় (Ihrlund et al।, 2008), হ্যামলেট-প্ররোচিত কোষের মৃত্যুতে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (পরিপূরক চিত্র S2F)। একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি দেখায় যে ক্যান্সার কোষগুলি হ্যামলেটের মারাত্মক প্রভাবগুলির সাথে সংবেদনশীল হয় যখন গ্লাইকোলাইসিস প্রতিরোধ করা হয়।

হ্যামলেট এইচকে 1-এ আবদ্ধ

গ্লাইকোলাইটিক পাথওয়েতে হ্যামলেটের সম্ভাব্য বাধ্যতামূলক অংশীদারদের একটি উচ্চ-সামগ্রী ফাংশনাল প্রোটিন অ্যারে ব্যবহার করে চিহ্নিত করা হয়েছিল যার উপর 8000 মানব রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন চিহ্নিত করা হয়েছিল (চিত্র 4 এ)। কঠোর পরিসংখ্যানীয় ফিল্টারিং ব্যবহার করে, নিউক্লিওটাইড-বাইন্ডিং প্রোটিন, প্রোটিন কিনাস এবং জিটিপি-বাইন্ডিং প্রোটিন সহ 87 টি উল্লেখযোগ্য হিট চিহ্নিত করা হয়েছিল। 5.09 (চিত্র 4 এ) এর জেড- স্কোর সহ গ্লাইকোলিটিক এনজাইম এইচকে 1 শীর্ষস্থানীয় স্কোর হিটগুলির মধ্যে একটি ছিল। এছাড়াও, বেশ কয়েকটি গ্লাইকোলিটিক এনজাইমগুলি ক্রমবর্ধমান HAMLET ঘনত্বের সাথে কম জেড- স্কোরগুলির সাথে সংকেতের তীব্রতা দেখিয়েছে, এইভাবে এই স্ক্রিনে ধনাত্মক হিটের জন্য কঠোর মানদণ্ডটি পূরণ করছে না ( জেড- স্কোর> 3) এবং স্পট এবং আন্তঃ অ্যারে সহনীয় পরিবর্তনের প্রতিলিপি (সিভি) <50%)। এই এনজাইমগুলিতে পিএফকেএফবি 2 এবং পিএফকেএফবি 4 (যথাক্রমে জেড- স্কোর 0.3 এবং 0.9), জিএপিডিএইচ (গ্লিসারালডিহাইড -3-ফসফেট ডিহাইড্রোজেনেস, জেড- স্কোর 0.5) এবং পিকেএম 2 ( জেড- স্কোর 0.1) অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। গ্লাইকোলিটিক এনজাইমগুলিতে হ্যামলেটকে আবদ্ধ করার বিষয়টি নিশ্চিত করতে, পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড ঝিল্লি পুনঃসংযোগকারী হিজ-ট্যাগড হিউম্যান এইচ 1 এবং পিকেএম 2, খরগোশের গ্লুকোজ-6-ফসফেট আইসোমেজ (জিপিআই, মানুষের সাথে 93% অভিন্ন) এবং বোভাইন সিরাম অ্যালবামিনকে নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল । এই ঝিল্লিটি ক্রমান্বয়ে হ্যামলেট বা α-ল্যাক্টালবামিন, ছাগলের অ্যান্টি-ল্যাক্টালবুমিন অ্যান্টিবডি এবং খরগোশের অ্যান্টি-ছাগল অশ্বেরোগ পেরোসাইড-কনজুগেটেড অ্যান্টিবডি দ্বারা সংক্রামিত হয়েছিল inc হ্যামলেট মানব এইচকে 1 এর সাথে দৃ bound়ভাবে আবদ্ধ তবে মানব পিকেএম 2, খরগোশের জিপিআই বা বোভাইন সিরাম অ্যালবামিনের সাথে নয় (চিত্র 4 বি)। এই শক্তিশালী ইন্টারঅ্যাকশনটি α-ল্যাক্টালবামিনের সাথে দেখা যায়নি, যা হ্যামলেট কমপ্লেক্সে HK1 এর সাথে নেটিভ, ফ্যাটি অ্যাসিড মুক্ত প্রোটিনের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চতর সখ্যতা দেখায়।

Image

হ্যামলেট এইচকে 1-এ আবদ্ধ। ( ) ৮০০০ প্রোটিন সমন্বিত একটি প্রোটিন অ্যারেতে, এইচএলএলটি ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে এইচকে 1 এর সাথে আবদ্ধ (5 বা 50 এনজি / μl) তবে পিকেএম 2 বা অন্যান্য গ্লাইকোলাইটিক এনজাইমগুলিতে নয়। ( ) সুদূর-পশ্চিম বিন্দু দাগে, HAMLET দৃ H়ভাবে মানব HK1 তে আবদ্ধ তবে অন্য তিনটি প্রোটিনের সাথে নয়। রিকম্বিন্যান্ট হিউম্যান-ট্যাগড এইচকে 1 এবং পিকেএম 2, খরগোশের পেশী জিপিআই এবং বিএসএকে পিভিডিএফ ঝিল্লিতে চিহ্নিত করা হয়েছিল এবং নিয়ন্ত্রণ হিসাবে হ্যামলেট (এইচএল) বা la-ল্যাক্টালবামিন (এএলএ) (উভয়ই 0.2 মিলিগ্রাম / এমএল) বা বাফার দ্বারা সংক্রামিত করা হয়েছিল। বাউন্ড হ্যামলেট বা α-ল্যাক্টালবামিন সনাক্ত করা হয়েছিল ছাগলের অ্যান্টি-la-ল্যাক্টালবুমিন এবং এইচআরপি-সংশ্লেষিত খরগোশের অ্যান্টি-ছাগলের অ্যান্টিবডিগুলি এবং ইমেজজে সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে কোয়ান্টিফায়েড। হ্যামলেটের জন্য চারটি (এইচকে 1 এবং পিকেএম 2) বা সাত (জিপিআই, বিএসএ) পরীক্ষার মধ্যম। Α-ল্যাক্টালবুমিনের জন্য এক পরীক্ষার ফলাফল। ( ) হ্যামলেট বিশেষত পেরিনিউক্লিয়ার অঞ্চলে এইচকে 1 এর সাথে সমাহারিত হয়েছিল। A549 কোষগুলিকে 15 মিনিটের জন্য আলেক্সা ফ্লুর 568-লেবেলযুক্ত HAMLET (এইচএল, লাল) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং অ্যান্টি-এইচ 1 এবং আলেক্সা ফ্লুর 488-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডিগুলিতে (সবুজ) দাগযুক্ত। স্কেল বার: 20 μ এম। ( d ) হ্যামলেট এইচকে ক্রিয়াকলাপ হ্রাস করেছে তবে পিরাভেট কিনেস বা গ্লুকোজ -6-ফসফেট আইসোমারেজ ক্রিয়াকলাপ ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে নয়। A549 কোষগুলিকে 15 মিনিটের জন্য বিভিন্ন হ্যামলেট ঘনত্বের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল, লাইসেটে ক্রিয়াকলাপ এবং ক্রিয়াকলাপটি একটি যুগল বর্ণালী। তিনটি পরীক্ষার মধ্যম + সেম

পূর্ণ আকারের চিত্র

কনফোকল মাইক্রোস্কোপি ক্যান্সার কোষগুলিতে HK1 এর সাথে HAMLET এর মিথস্ক্রিয়াটি কল্পনা করতে ব্যবহার করা হয়েছিল। A549 ফুসফুস কার্সিনোমা কোষগুলি অ্যালেক্সা ফ্লুর 568-লেবেলযুক্ত হ্যামলেট (15 মিনিট, 21 μ এম) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল, অ্যান্টি-এইচকে 1 অ্যান্টিবডিগুলি (চিত্র 5 সি) দিয়ে স্থির এবং দাগযুক্ত। অ্যান্টি-পিকেএম 2 অ্যান্টিবডিগুলির সাথে দাগযুক্ত কক্ষগুলি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হত (পরিপূরক চিত্র এস 3)। চিকিত্সা করা কোষগুলি পেরিনিউক্লিয়র অঞ্চলে (চিত্র 5 সি) সর্বোচ্চ তীব্রতার সাথে দানাদার এইচকে 1 দাগ দেখায়। হ্যামলেট-চিকিত্সা কোষগুলিতে, বিশেষত পেরিনিউক্লিয়ার, বৃত্তাকার সমষ্টিগুলিতে এইচএএমএলটি এবং এইচকে 1 এর মধ্যে একটি শক্তিশালী সমাহার লক্ষ্য করা গেছে। বিপরীতে, HAMLET সহ কেবল PKM2 এর একটি দুর্বল সমষ্টিকরণ সনাক্ত করা হয়েছে (পরিপূরক চিত্র S3)।

Image

গ্লাইকোলাইসিস সম্পর্কিত প্রোটিনগুলির নকআডাউন হ্যামলেট সংবেদনশীলতা পরিবর্তন করে। ( a, b ) A549 কোষগুলি এইচকে 1 বা পিকেএম 2 লক্ষ্য করে নিয়ন্ত্রণের সিআরএনএ বা সিআরএনএ দ্বারা স্থানান্তরিত হয়েছিল। 2 দিন পরে, নকউডাউনটি কিউপিআরসি ( ) এবং জিএপিডিএইচ দিয়ে ওয়েস্টার্ন ব্লটকে লোডিং নিয়ন্ত্রণ ( ) হিসাবে নিশ্চিত করেছে। আপেক্ষিক এমআরএনএ স্তরগুলি দেখানো হয় (সিটি সিআরএনএ-ট্রান্সফেক্টেড কোষের% স্তরে PKM2 / পিপিআইএ এবং এইচকে 1 / পিপিআইএ)। 3-5 পরীক্ষার মধ্যম + সেম ( ) এইচকে 1 সিআরএনএগুলি A549 কোষে HAMLET এর সাইটোঅক্সিক প্রভাব বাড়িয়েছে। A549 কোষগুলিকে HK1 টার্গেট করে siRNA গুলি, পিকেএম 2 লক্ষ্য করে siRNA বা siRNA গুলি নিয়ন্ত্রণ করে এবং 2 দিন পরে, হ্যামলেট (3 এইচ) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। সম্পর্কিত চিকিত্সা করা কোষগুলিতে% স্তরে এটিপি স্তর এবং কার্যকারিতা। 3-5 পরীক্ষার গড় + সেম * পি <0.05। ( d, e ) PFKFB1 siRNA A549 কোষে HAMLET এর সাইটোঅক্সিক প্রভাব হ্রাস পেয়েছে। A549 কোষগুলি পিএফকেএফবি 1 সিআরএনএ দ্বারা নিয়ন্ত্রণ করা হয়েছিল বা 48 ঘন্টা হ'ল হ্যামলেটের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছে। ( d ) সংশ্লিষ্ট চিকিত্সা করা কোষগুলিতে% স্তরে এটিপি স্তর। তিনটি পরীক্ষার মধ্যম + সেম * পি <0.05। ( ) পিএফকেএফবি 1-এর নকআডাউন QPCR এবং পশ্চিমের দোষ দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল।

পূর্ণ আকারের চিত্র

হ্যামলেট ক্যান্সার কোষগুলিতে এইচকে ক্রিয়াকলাপ হ্রাস করে

HAMLET ক্যান্সার কোষগুলিতে গ্লাইকোলাইসিসকে ব্যাঘাত ঘটায় কিনা তা নির্ধারণের জন্য, HKLET- চিকিত্সা A549 ফুসফুস কার্সিনোমা কোষগুলি (7, 21 এবং 36 μ M) মিলিত স্পেকট্রোফোটোমেট্রিক অ্যাসেস দ্বারা ডিটারজেন্টমুক্ত লাইসেটগুলিতে এইচকে, পিকে এবং জিপিআই ক্রিয়াকলাপগুলি পরিমাপ করা হয়েছিল। এইচকে ক্রিয়াকলাপ হ্যামলেট চিকিত্সার (চিত্র 4 ডি) এর 15 মিনিটের পরে হ্রাসের দিকে ডোজ-নির্ভর প্রবণতা দেখিয়েছিল, তবে জিপিআই এবং পিকে ক্রিয়াকলাপগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়নি। এই প্রারম্ভিক সময়ে, সেল মরফোলজিতে বা সেলুলার এইচকে 1 স্তরে (পরিপূরক চিত্রগুলি এস 4 এ এবং খ) কোনও পরিবর্তন হয়নি। এটিপি মাত্রা ইতিমধ্যে 15 মিনিটে একটি ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে হ্রাস পেয়েছে তবে ল্যাকটেট উত্পাদন কেবল 3 ঘন্টা (পরিপূরক চিত্র এস 4 সি) এর পরে হ্রাস পেয়েছিল। ফলাফলগুলি সুপারিশ করে যে HAMLET ফুসফুস কার্সিনোমা কোষগুলিতে এইচকে ক্রিয়াকলাপ হ্রাস করতে পারে।

এইচকে 1 বা পিএফকেএফবি 1 এর নকআডাউন হ্যামলেট সংবেদনশীলতা সংশোধন করে

এইচআরএনএ স্ক্রিনটি যাচাই করতে এবং এইচএএমএলএটি-প্ররোচিত কোষের মৃত্যুতে গ্লাইকোলাইসিস সম্পর্কিত প্রোটিনের ভূমিকা পরীক্ষা করার জন্য, এ 549 ফুসফুস কার্সিনোমা কোষগুলি এইচকে 1, পিএফকেএফবি 1 এবং পিকেএম 2 টার্গেট করে ছোট-হস্তক্ষেপকারী আরএনএ (সিআরএনএ) দ্বারা ক্ষণস্থায়ীভাবে স্থানান্তরিত হয়েছিল। নকউডাউনটি কিউপিআরসি এবং ওয়েস্টার্ন ব্লট (চিত্র 5 এ, বি এবং ই) দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল, এবং হ্যামলেটের সংবেদনশীলতাটি এটিপি স্তর এবং ট্রাইপান নীল বর্জন পরিমাপের মাধ্যমে পরিমাপ করা হয়েছিল (চিত্র 5 সি এবং ডি)। এইচকে 1 সিআরএনএ-ট্রান্সফেক্টেড কোষগুলি হ্যামলেট (21 এবং 36 ডিগ্রি এম, পি <0.05) এর প্রতিক্রিয়ায় এন্টি-র আরও স্পষ্ট ক্ষতির পরিমাণ দেখিয়েছে তুলনামূলকভাবে অনিরাপদযুক্ত কোষ বা কোষের নিয়ন্ত্রণের সাথে সেরার পরিবর্তে কোষের সিলএনএ। বিপরীতে, পিকেএম 2 সিআরএনএ হ্যামলেট (চিত্র 5 সি) এর সংবেদনশীলতা পরিবর্তন করে নি। অনুরূপ ফলাফল ট্রিপ্যান নীল বর্জনের সাথে দেখা হয়েছে। তদ্ব্যতীত, পিএফকেএফবি 1-এর নকআডাউন, যা এইচআরএনএ স্ক্রিনে প্রতিরোধকে সম্মানিত করে, হ্যামলেট (চিত্র 5 ডি) এর সংবেদনশীলতা হ্রাস করে। এই ফলাফলগুলি নিশ্চিত করে যে HK1 এবং PFKFB1 এর নকআডাউন যথাক্রমে HAMLET সংবেদনশীলতা বৃদ্ধি এবং হ্রাস করে।

হ্যামলেট দ্রুত ক্যান্সার কোষ বিপাককে ব্যহত করে

HAMLET কোষের বিপাকীয় অবস্থার পরিবর্তন করে কিনা তা নির্ধারণের জন্য, আমরা চিকিত্সা না করা কোষগুলির সাথে হ্যামলেট-চিকিত্সা ফুসফুস কার্সিনোমা কোষগুলির (36 μ এম, 15 মিনিট এবং 1 জ) এর বিপাকীয় প্রোফাইলের তুলনা করেছি (চিত্র 6 এবং পরিপূরক চিত্র এস 5)। হ্যামলেটের সম্ভাব্য বিপাকীয় প্রভাবগুলি অধ্যয়ন করার জন্য তিনটি পৃথক চিহ্নহীন বিপাকীয় প্রোফাইলের পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়েছিল। রিভার্স-ফেজ লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফির সাথে মিলিত ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নাইজেশন স্পেকট্রোম্যাট্রি (এলসি-এমএস) হাইড্রোফোবিক বিপাক (যেমন লিপিডস), হাইড্রোফিলিক ইন্টারঅ্যাকশন ক্রোমাটোগ্রাফি এবং এলসি-এমএস ব্যবহার করা হয়েছিল বিস্তৃত মেরু বিপাক গবেষণা এবং গ্যাস ক্রোমাটোগ্রাফি ম্যাস স্পেকট্রোমেট্রি (জিসি-এমএস) থেকে প্রোফাইল কোর বিপাক (বারান এট আল।, ২০০৯)। রিভার্স-ফেজ এলসি-এমএস প্রোফাইলিংয়ের মাধ্যমে, এম / জেড মান এবং এলসি ধরে রাখার সময় দ্বারা নির্ধারিত ( এম / জেড মান এবং সংমিশ্রনের জন্য) একই মেটোবোলাইটের বিভিন্ন অ্যাডাক্টস, আইসোটোপস এবং ইন-উত্স অবক্ষয় পণ্য সহ) 560 টি বৈশিষ্ট্য সনাক্ত করা হয়েছিল ( ধরে রাখার সময়, চিত্র 6 এ দেখুন)। বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে হ্যামলেট চিকিত্সার 15 মিনিটের পরে 560 বৈশিষ্ট্যের মধ্যে 125 টি উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তন করা হয়েছিল (107 বৃদ্ধি পেয়েছে, 18 হ্রাস হয়েছে)। 1 ঘন্টা পরে, 76 টি পরিবর্তিত বৈশিষ্ট্যগুলির সিংহভাগ পরিবর্তে হ্রাস করা হয়েছে (22 বৃদ্ধি পেয়ে 54 হ্রাস করা হয়েছে) (চিত্র 6 ডি)। হ্যামলেটের উত্থাপিত থেকে প্রত্যাশিত হিসাবে, উভয় সময় পয়েন্টে হ্যামলেট-চিকিত্সা কোষগুলির মধ্যে সবচেয়ে বড় সংকেত তীব্রতা সহ বৈশিষ্ট্যগুলি এবং একই ধরণের ধারণার সময় সহ বেশ কয়েকটি বৈশিষ্ট্যগুলি হ'ললেটের লিপিড উপাদান, হেল্লেটের লিপিড উপাদান, অলিক অ্যাসিডের আইয়োটিজেশন এবং আইসোটোপ রূপগুলি হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল based সঠিক ভর এবং এলসি ধরে রাখার সময়।

Image

হ্যামলেট ক্যান্সার কোষ বিপাক বাধা দেয়। ( - ) হ্যামলেট-চিকিত্সা (15 মিনিট এবং 1 এইচ) মধ্যে বিপাকের পরিবর্তনগুলি এলসি-এমএস রিভার্স-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি দ্বারা এ 549 কোষ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ( ) মোট, 520 টি বৈশিষ্ট্য, ধারণের সময় এবং মি / জেড মান দ্বারা সংজ্ঞায়িত, সনাক্ত করা হয়েছিল। ( ) ল্যামের ফ্রিকোয়েন্সি বিতরণ হ্যামলেট-চিকিত্সা এবং নিয়ন্ত্রণ কোষগুলির মধ্যে সংকেতের তীব্রতায় 2-রূপান্তরিত ভাঁজ পরিবর্তনগুলি। 15 মিনিটের পরে গড় সংকেতের তীব্রতায় দ্রুত বৃদ্ধির পরে, হ্যামেলের প্রতিক্রিয়া হিসাবে গড়ে সিগন্যালের তীব্রতা হ্রাস লক্ষ্য করা গেছে। ( ) একটি নিখুঁত লগ 2-গুণ পরিবর্তন fold1 এবং পি- মূল্যগুলি -0.05 দেখানো বৈশিষ্ট্যগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হিসাবে বিবেচিত হয়েছিল। ( d ) এই সংজ্ঞাটি ব্যবহার করে, 125 টি বৈশিষ্ট্যগুলি হ'ললেটের সাথে 15 মিনিটের জন্য চিকিত্সা করা কোষগুলিতে এবং স্বতন্ত্র নিয়ন্ত্রণ কোষের তুলনায় 1 ঘন্টার জন্য চিকিত্সা করা কোষগুলিতে 76 টি বৈশিষ্ট্যগুলিতে পরিবর্তিত হতে দেখা গেছে। সব মিলিয়ে এই বৈশিষ্ট্যগুলির মধ্যে 24 টি উভয় সময় পয়েন্টে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তন করা হয়েছিল। ( ) লগ 2-রুপান্তরিত ভাঁজ পরিবর্তনগুলি রঙ দ্বারা নির্দেশিত উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত বৈশিষ্ট্যের প্লট।

পূর্ণ আকারের চিত্র

হাইড্রোফিলিক ইন্টারঅ্যাকশন ক্রোমাটোগ্রাফি এলসি-এমএস ব্যবহার করে অবাক করা প্রোফাইলিং বিপরীত-পর্যায়ের বিশ্লেষণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, হ্যামলেট চিকিত্সার পরে উল্লেখযোগ্য বিপাকীয় পরিবর্তনগুলি দেখায়। যে 1120 টি বৈশিষ্ট্য সনাক্ত করা হয়েছিল তার মধ্যে 103 টি 15 মিনিটের পরে পরিবর্তিত হয়েছে (হ্যামলেট চিকিত্সা কোষগুলিতে 75 টি হ্রাস করা হয়েছিল) এবং 114 টি হ্যামলেট চিকিত্সার পরে (64 বৃদ্ধি পেয়েছে, 50 হ্যামলেট-চিকিত্সায় হ্রাস পেয়েছে) কোষ)। বিশ্লেষণী মানগুলির সাথে সঠিক ভর এবং ধারণক্ষমতা সময়ের তুলনার ভিত্তিতে এই বিপাকগুলির বেশ কয়েকটি সনাক্ত করা হয়েছিল। এস- এডেনোসিল- এল-হোমোসিস্টাইন, ক্রিয়েটাইন, ফসফোক্রেটিন, টাউরিন এবং গ্লুটাথায়ন ডিসলফ্লাইড হ্যামলেট-চিকিত্সা কোষগুলিতে হ্রাস পেয়েছে, সম্ভবত অ্যামিনো অ্যাসিড বিপাক এবং অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের ব্যত্যয়কে প্রতিফলিত করে। পরবর্তী এমএস / এমএস বিশ্লেষণ দ্বারা ক্রিয়েটাইন এবং গ্লুটাথিয়ন ডিসলফাইডের পরিচয়ও নিশ্চিত করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে হ্যামলেট দ্রুত ক্যান্সার কোষ বিপাক পরিবর্তন করে।

সেলুলার বিপাকের জিসি-এমএস প্রোফাইলিং পরে A549 ফুসফুস কার্সিনোমা কোষগুলিতে 15 এবং 60 মিনিটের জন্য হ্যামলেটের সাথে চিকিত্সা করা হয়। শ্রেণিবদ্ধ ক্লাস্টারিংয়ের মাধ্যমে, তিনটি পৃথক ক্লাস্টার পরিলক্ষিত হয়েছিল, প্রথমটিতে নিয়ন্ত্রণের নমুনা (15 এবং 60 মিনিট), দ্বিতীয় হ্যামলেট-চিকিত্সা নমুনাগুলি যথাক্রমে 15 মিনিটের পরে এবং তৃতীয় 60 মিনিটের নমুনাগুলি প্রাপ্ত হয়েছিল (চিত্র 7 এ, পরিপূরক সারণী এস 2)। নিয়ন্ত্রণের তুলনায় হ্যামলেট -60 নমুনায় সামগ্রিক বিপাকের ঘনত্ব কম ছিল, যা অচিহ্নবদ্ধ প্রোফাইলিংয়ে চিহ্নিত বিপাকের সাধারণ শাট ডাউনকে নিশ্চিত করে। উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত বিপাক সংগ্রহগুলি আবিষ্কার করার জন্য, 1 এবং মিথ্যা আবিষ্কারের হারের (এফডিআর) অ্যাডজাস্টেড পি- মূল্যগুলি <0.05 এর সম্পূর্ণ লগ 2-ভাড়ার পরিবর্তনযুক্ত ডেটা এবং বিপাকগুলির সাথে একটি রৈখিক মডেল লাগানো হয়েছিল। সব মিলিয়ে, 20 টি বিপাকগুলি হ্যামলেট চিকিত্সার 15 মিনিটের পরে (চিত্র 7 বি) উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তন করা হয়েছিল। হ্যামলেটের জ্ঞাত আপটেক থেকে প্রত্যাশিত হিসাবে ওলাইক অ্যাসিড এবং এর ডেরাইভেটিভ এলাইডিক অ্যাসিড সর্বাধিক চিহ্নিত বৃদ্ধি (যথাক্রমে 120 গুণ, পি- ভ্যালু = 4 × 10 −6 এবং 84 এবং 8.1 × 10 −6 ) প্রদর্শিত হয়েছিল। এছাড়াও, গ্লুকোনিক অ্যাসিড (৩.৩-ভাঁজ), গ্লুকোনেট-ল্যাকটোন (২.6-ভাঁজ), গ্লিসারিক অ্যাসিড (২-ভাঁজ) এবং পাইরুভেট (১.7-ভাঁজ) সহ 15 মিনিটের পরে বেশ কয়েকটি অন্যান্য বিপাকের পরিমাণ বেশি ছিল। বিপাকীয় যেগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে তার মধ্যে রয়েছে টাউরাইন, গ্লাইসাইন, সাইট্রিক অ্যাসিড চক্র অন্তর্বর্তী একনাইটেট এবং পলিমাইনস পোট্রেসিন এবং স্পার্মিডিন।

Image

জিসি-এমএস বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত ফলাফলের ভিত্তিতে হায়ারারিকিকাল ক্লাস্টারিং হ্যামলেট এবং নিয়ন্ত্রণের নমুনাগুলি পৃথক করে। ( a, b ) সামগ্রিকভাবে, 113 বিপাকগুলি হ্যামলেট-চিকিত্সার পরে GC-MS 15 মিনিট এবং 1 ঘন্টা ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ( ) সমস্ত বিপাক ব্যবহার করে হায়ারারিকিকাল ক্লাস্টারিং নিয়ন্ত্রণের নমুনাগুলি হ্যামলেট-চিকিত্সা (15 মিনিট এবং 1 জ) নমুনাগুলি থেকে পৃথক করে। হ্যামলেট চিকিত্সার পরে পরিমাপকৃত বিপাকের বেশিরভাগ অংশ হ্রাসযোগ্য (লাল) 1 ঘন্টা ছিল। আপগ্রেগুলেটেড বিপাক (সবুজ) এর মধ্যে ওলিক অ্যাসিড এবং এর ডেরাইভেটিভ অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। ( ) 15 ও 1 এইচতে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত বিপাকের উপর ভিত্তি করে হায়ারারিকিকাল ক্লাস্টারিং।

পূর্ণ আকারের চিত্র

1 ঘন্টা পরে, 41 বিপাকগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হিসাবে চিহ্নিত হয়েছে (চিত্র 7 বি)। ওলেইক অ্যাসিড (5.1 এবং পি = 2 × 10 − 10 এর লগ 2-ভাঁজ পরিবর্তন) এর ডেরাইভেটিভগুলির সাথে ইলেডিক অ্যাসিড এবং প্যালিমিটোলিক অ্যাসিড সহ একসাথে দ্বিতীয় সর্বাধিক চিহ্নিত বৃদ্ধি দেখিয়েছে। প্যারুভেট এবং সাইট্রিক অ্যাসিড চক্রের বেশ কয়েকটি মধ্যস্থতাকারী, সাকসিনেট, অ্যাকোনিট, ফিউমারেট এবং ম্যালেট সহ, হ্যামলেট চিকিত্সার পরে কম প্রচুর ছিল, যা গ্লাইকোলাইসিসের উপর হ্যামলেটের বাধা প্রভাবকে নিশ্চিত করে। এছাড়াও, এস্পারেট, গ্লুটামেট এবং স্পার্মিডিন সহ অন্যান্য বেশ কয়েকটি কী বিপাক বিপাক হ্রাস করা হয়েছিল। অবশেষে, অচিহ্নবদ্ধ বিপাকীয় বিশ্লেষণের নিশ্চয়তা দিয়ে, হ্যামলেট গ্লুটাথিয়ন বিপাক সম্পর্কিত বিপাকের হ্রাস ঘটায়। একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি দেখায় যে হ্যামলেট দ্রুত ক্যান্সার কোষ বিপাকের বিশাল পরিবর্তন ঘটায় যা গ্লাইকোলাইসিস বিঘ্নিত হওয়ার ফলে অংশ হতে পারে।

আলোচনা

হ্যামলেট হ'ল টিউমারিসিডাল উদ্ঘাটিত প্রোটিনের একটি নতুন পরিবারের প্রথম সদস্য – লিপিড কমপ্লেক্সগুলি যা ক্যান্সার কোষগুলিকে বিস্তৃতভাবে হত্যা করে, বিচ্ছিন্ন, অ-রূপান্তরকৃত কোষকে ছাড়ায় (হাকানসন এট আল।, 1995; স্বেসন এট আল।, 2000)। ভিট্রোতে ক্যান্সার কোষকে মেরে ফেলার ক্ষমতা ছাড়াও, হ্যামলেটটি ত্বকের পেপিলোমাসের বিরুদ্ধে চিকিত্সামূলক কার্যকারিতা এবং মানব মূত্রাশয় ক্যান্সারের উপর দ্রুত সাময়িক প্রভাব দেখিয়েছে (গুস্তাফসন এট আল।, 2004; মোসবার্গ এট আল।, 2007)। হিউম্যান গ্লিওব্লাস্টোমা বা মূত্রাশয়ের ক্যান্সারের প্রাণীদের মডেলগুলিতে, হ্যামলেট বেঁচে থাকা এবং টিউমার বিকাশের ক্ষেত্রে বিলম্ব দেখানো হয়েছে (ফিশার এট আল।, 2004; মোসবার্গ এট আল।, ২০১০)। এখনও অবধি, স্বাস্থ্যকর টিস্যুগুলিতে বিষাক্ত প্রভাবগুলি শনাক্ত করা যায়নি, যা পরামর্শ দেয় যে হ্যামলেট তার ক্রিয়াকলাপের জন্য ক্যান্সার কোষগুলির সংরক্ষিত বৈশিষ্ট্যগুলি কাজে লাগায়। এই সংরক্ষণ করা বৈশিষ্ট্যগুলির কয়েকটি এখানে চিহ্নিত করা হয়েছিল। ক্যান্সার কোষগুলির হ্যামলেট সংবেদনশীলতা সি-মাইক অনকোজিন এক্সপ্রেশন এবং গ্লাইকোলিটিক যন্ত্রপাতি, বিশেষত এইচকে 1 এবং পিএফকেএফবি 1, এবং এইচআইএফ 1α এর উপর নির্ভরশীল হিসাবে দেখানো হয়েছিল, যা হাইপোক্সিয়া এবং অনকোজিন ক্রিয়াকলাপ দ্বারা সক্রিয় এবং গ্লাইকোলাইটিক এনজাইম, গ্লুকোজ ট্রান্সপোর্টারগুলির ট্রান্সক্রিপশন বৃদ্ধি করে কাজ করে এবং ল্যাকটেট ডিহাইড্রোজেনেস (কিম এট।, 2006; পাপানড্রেও এট আল।, 2006)।

সি-মাইককে 'কুইন্টেসেন্টিয়াল অনকোজিন' (লি এট আল।, ১৯৮৪; নীলসন এবং ক্লিভল্যান্ড, ২০০৩) বলা হয় তবে এর প্রভাবগুলি বিপরীতমুখী থেকে যায় কারণ সাধারণ কোষে সি-মাইক একা প্রবর্তন করলে কোষের মৃত্যু ঘটে (ইভান এট আল।, 1992)। ক্যান্সার কোষগুলিতে, প্রত্যক্ষভাবে বা বিভিন্ন নিয়ন্ত্রক সার্কিটের মাধ্যমে সমস্ত প্রকাশিত জিন না হলে সি-মাইক ওভাররেইপশন কমপক্ষে 30% প্রভাবিত করে। যেহেতু হ্যামলেট বিভিন্ন প্রজাতি, টিস্যু এবং ব্যক্তিদের থেকে> 40 টি বিভিন্ন টিউমার কোষের বিপরীতে কার্যকলাপ দেখিয়েছে, তাই সর্বব্যাপী অনকোজিন সি-মাইকের সংবেদনশীল প্রভাব সম্পূর্ণ অপ্রত্যাশিত ছিল না। সি-মাইকের উচ্চ স্তরের প্রকাশিত টিউমার কোষগুলি স্বাস্থ্যকর পৃথকীকৃত কোষের চেয়ে হ্যামলেটের সংস্পর্শে আসার সাথে সাথে খুব সহজেই মারা যায় এবং সি-মাইকের নকআডাউন হ্যামলেট সংবেদনশীলতা হ্রাস করে। ওয়ার্কবার্গ এফেক্ট এবং বায়বীয় গ্লাইকোলাইসিসে ক্যান্সার কোষের নির্ভরতার প্রচারের জন্য সি-মাইক অনকোজিন প্রস্তাব করা হয়েছে। সুতরাং, ওভারেক্টিভ সি-মাইক হ্যামলেট দ্বারা গ্লাইকোলাইসিস নিয়ন্ত্রণের জন্য ক্যান্সার কোষকে অতিরিক্ত সংবেদনশীল করে তুলতে পারে। নিজেই সি-মাইক ছাড়াও, রাস সংকেত পথটি জিএসইএ বিশ্লেষণ দ্বারা হ্যামলেট সংবেদনশীলতার একটি নির্ধারক হিসাবে চিহ্নিত হয়েছিল এবং সি-মাইক রাসের প্রবাহে স্রোত হয়, ফলে কোষের বিস্তার এবং বেঁচে থাকা যেমন ফসফিনোসাইটাইড 3-কিনেসের মতো অন্যান্য প্রভাবকের সাথে একত্রিত হয়। আমরা দেখতে পেয়েছি যে হ্যামলেটটি মাইটোজেন-অ্যাক্টিভেটেড প্রোটিন কিনেজ কিনেস / এক্সট্রা সেলুলার সিগন্যাল-নিয়ন্ত্রিত কিনেস থেকে টিউমার কোষগুলিতে পি 38 সিগন্যাল এ স্থানান্তরিত করে এবং সেই পি 38 হ্যামলেটের প্রাথমিক কোষের মৃত্যুর প্রতিক্রিয়াতে জড়িত (স্টর্ম এট আল। প্রস্তুতিতে পাণ্ডুলিপি) । বিপরীতে, স্বাস্থ্যকর কোষগুলি রস / মাইটোজেন-অ্যাক্টিভেটেড প্রোটিন কিনেজ পথ এবং সি-মাইক এক্সপ্রেশনে স্বল্প অভ্যন্তরীণ ক্রিয়াকলাপ দ্বারা চিহ্নিত করা হয় এবং হ্যামলেট এক্সপোজারের সময় একটি ভারসাম্য মাইটোজেন-অ্যাক্টিভেটেড প্রোটিন কাইনাস ক্রিয়াকলাপ বজায় রাখে, সামান্য p38 অ্যাক্টিভেশন সহ, তাদের নিম্নের সাথে সামঞ্জস্য থাকে হ্যামলেট সংবেদনশীলতা। ক্যান্সার কোষগুলিতে মিউট্যান্ট সি-মাইক দ্বারা সৃষ্ট অনকোজিন আসক্তি এবং উচ্চ বিপাকীয় ক্রিয়াকলাপগুলি এই কোষগুলি HAMLET দ্বারা গ্লাইকোলাইসিস নিয়ন্ত্রণের জন্য অতিরিক্ত সংবেদনশীল করে তুলতে পারে, সি-মাইকের প্রভাবগুলি ক্যান্সার কোষের মৃত্যুর সাথে সংযুক্ত করে।

সি-মাইক ছাড়াও, এইচআইএফ 1α, দ্বিতীয় ক্যান্সার কোষের বিপাককে সংশোধন করার জন্য সুপরিচিত, হ্যামলেটের সংবেদনশীলতা নিয়ন্ত্রণে জড়িত ছিল। এইচআইএফ 1α গ্লুকোজ ট্রান্সপোর্টারস এবং এইচকে 1 (ড্যাং এট আল।, ২০০ including) সহ গ্লাইকোলাইটিক মেশিনের গুরুত্বপূর্ণ উপাদানগুলির প্রতিলিপি বৃদ্ধি করে কাজ করে। এটি প্রস্তাব করা হয়েছে যে এইচআইএফ 1 কেবলমাত্র অটো ওয়ারবর্গ দ্বারা চিহ্নিত চিহ্নিত (ডেনকো, ২০০৮) অনকোজেনিক রূপান্তর সহ বড় ধরনের বিপাকীয় পরিবর্তনগুলি চালনা করতে পারে। এই সমন্বয়টি এইচআরএনএ স্ক্রিনে এইচকে 1 এবং এইচআইএফ 1 এর হ্যামলেট সংবেদনশীল প্রভাবগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এছাড়াও, অনকোজেনিক সি-মাইকের নিয়ন্ত্রিত অভিব্যক্তি টিউমার বিপাকীয় ফিনোটাইপ প্রদানে HIF1α এর সাথে সহযোগিতা করে। অদ্ভুতভাবে, শারীরবৃত্তীয় অবস্থার অধীনে, এইচআইএফ 1α সি-মাইক এবং এইচআইএফ 1α এর ক্রিয়াকলাপকে সরাসরি বাধা দিতে পারে, যা এমএক্সআই 1-র প্রকাশকে সরাসরি প্রভাবিত করে, যা ম্যাক্সকে আবদ্ধ করে, এর ফলে সি-মাইক (জ্যাং এট আল।, 2007) এর প্রতিকূলতা বিরোধী করে তোলে। এইচআইএফ 1α একটি প্রোটোসোম নির্ভর নির্ভর পথের মাধ্যমে সি-মাইক প্রোটিনের স্তরকে কমিয়ে সি-মাইক কার্যকলাপকে হ্রাস করে। HIF1α এর বিপরীতে, HIF2α কে এমওয়াইসি – ম্যাক্স কমপ্লেক্সকে স্থিতিশীল করতে দেখানো হয়েছে, যার ফলে সি-মাইক-প্রেরণা প্রতিলিপি উত্সাহিত করে। সুতরাং, হ্যামলেট সংবেদনশীলতার উপর সি-মাইকের প্রভাবগুলি কেবল গ্লাইকোলাইসিসের তার নিয়ন্ত্রণকে প্রতিফলিত করতে পারে না likely এই ক্ষেত্রে, প্রাসঙ্গিক-নির্ভর সি-মাইক-মধ্যস্থতা প্রতিলিপি টিউমার অগ্রগতির জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ এবং হ্যামলেট সংবেদনশীলতার জন্যও এটি হতে পারে।

টিউমার কোষের গ্লাইকোলিটিক অবস্থাটি shRNA স্ক্রিন দ্বারা HAMLET সংবেদনশীলতার একটি নির্ধারক হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল এবং এক্সট্রা সেলুলার গ্লুকোজ স্তরগুলি হ্যামলেটে টিউমার কোষের সংবেদনশীলতাকে পরিবর্তন করতে দেখানো হয়েছিল। তদ্ব্যতীত, shRNA স্ক্রিনের জিএসইএ বিশ্লেষণে গ্লাইকোলাইসিস সম্পর্কিত বিভিন্ন পথকে হ্যামলেট সংবেদনশীলতার জন্য গুরুত্বপূর্ণ হিসাবে চিহ্নিত করেছে। HK1 হ্যামলেটের সরাসরি টার্গেট ছিল, যেমন 8000 প্রোটিনযুক্ত একটি প্রোটমিক পর্দায় এবং ডট ব্লটগুলিতে আবদ্ধ হয়ে দেখা যায় যেখানে বিশুদ্ধ মানব HK1 – হ্যামলেট যোগাযোগের বিষয়টি নিশ্চিত হয়েছিল। এইচকে 1 এবং এইচকে 1 হোমোলজ এইচকে 2 এর প্রতিরোধে গ্লুকোজ ফসফোরিলেশন হ্রাস করার পূর্বাভাস দেওয়া হবে, যার ফলে ক্যান্সারের কোষগুলিতে গ্লাইকোলাইসিস প্রতিরোধ করে গ্লুকোজ বঞ্চনার মতো একটি রাষ্ট্র তৈরি হবে। এইচকে 1/2 আইসোফর্মগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল ঝিল্লির সাথে যুক্ত, যেখানে তারা গ্লুকোজ ব্যবহার নিয়ন্ত্রণ করে। তদ্ব্যতীত, এইচকে 1 ভোল্টেজ-নির্ভর অ্যানিয়ন চ্যানেল কন্ডাক্টেন্স হ্রাস করে, ফলে কোষগুলি সিটোক্রোম সি রিলিজ এবং অ্যাপোপোটিক মৃত্যুর হাত থেকে রক্ষা করে (আবু-হামাদ এট আল।, ২০০৮)। একটি সমান্তরাল গবেষণায়, আমরা দেখিয়েছি যে আয়ন চ্যানেল অ্যাক্টিভেশন হ্যামলেট-প্রেরিত কোষের মৃত্যুর (স্টর্ম এট আল। , প্রস্তুতিতে পাণ্ডুলিপি) একটি জটিল ঝিল্লির ঘটনা, এই সম্ভাবনা বাড়িয়ে তোলে যে গ্লাইকোলাইসিসের প্রভাব ছাড়াও, এইচকে 1 সংশোধন করে কাজ করে মাইটোকন্ড্রিয়াল ঝিল্লিতে আয়ন চ্যানেলগুলির সাথে হ্যামলেটের ইন্টারঅ্যাকশন। আমরা আরও দেখেছি যে কোলন ক্যান্সারে আক্রান্ত এপিসি মিন ইঁদুরের পেরোলাল হ্যামলেট চিকিত্সা ভিভোতেও এই লক্ষ্যগুলির প্রাসঙ্গিকতার প্রস্তাব দেয়, বহু গ্লাইকোলাইসিস সম্পর্কিত প্রোটিনের (লিথিয়া এট আল। , পাণ্ডুলিপি) প্রতিলিপি পরিবর্তন করে।

এইচআরএনএ স্ক্রিনটি পিকেএফকেবি 1 কে হ্যামলেট সংবেদনশীলতার একটি উল্লেখযোগ্য নির্ধারক হিসাবে চিহ্নিত করেছে, কিন্তু এইচকে 1 এর বিপরীতে, পিকেএফকেবি 1 এসআরএনএর প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব রয়েছে। এর পেছনের প্রক্রিয়াটি তাত্ক্ষণিকভাবে সুস্পষ্ট নয় কারণ চারটি পিএফকেএফবি আইসফর্মগুলি ক্রাইনেস এবং বিসফোস্প্যাটেস ক্রিয়াকলাপের অধিকারী, স্বাধীন ডোমেনগুলি যথাক্রমে ফ্রুটোজ-2, 6-বাইফসফেটের সংশ্লেষণ বা অবনতি সংশ্লেষণ করে বা অবনতি ঘটায়। গ্লাইকোলাইসিসের ফলস্বরূপ প্রভাবটি সম্পূর্ণ কাইনাস দ্বারা নির্ধারিত হয়: প্রতিটি কোষে বিসফসফেটেজ অনুপাত। পিএফকেএফবি 1, পিএফকেএফবি 2 এবং পিএফকেএফবি 4 এর সমান কিনেজ এবং বিস্ফোস্প্যাটেস ক্রিয়াকলাপ রয়েছে, যেখানে পিএফকেএফবি 3 এর শক্তিশালী কিনেস ক্রিয়াকলাপ রয়েছে (740: 1) এবং ক্যান্সারের কোষগুলিতে অত্যধিক প্রভাবিত হয়েছে (ইয়ালকিন এট আল।, ২০০৯)। পিএফকেএফবি 1-এর নকআডাউন পিএফকেএফবি 3 আইসফর্মের আধিপত্য বাড়িয়ে তুলতে পারে ফলে উচ্চতর ফ্রুকটোজ-2, 6-বিস্ফোফেট স্তর এবং বর্ধিত গ্লাইকোলাইসিস হতে পারে। এটি পিএফকেএফবি 1 নক আউট হওয়ার পরে উদ্ধারের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ হবে, কারণ ওয়ারবার্গ ফেনোটাইপযুক্ত একটি কোষে গ্লাইকোলাইসিস হ্রাস হ্যামলেট-প্ররোচিত কোষের মৃত্যুর পক্ষে বলে মনে হয়।

অবশেষে, একটি বিস্তৃত বিপাকীয় স্ক্রিন প্রদর্শন করেছে যে হ্যামলেট-চিকিত্সা কোষগুলি দ্রুত বিপাক ক্রিয়াকলাপ looseিলা করে। এলসি-এমএস এবং জিসি-এমএস প্রোফাইলিংয়ে দেখানো হয়েছে, হ্যামলেট ক্যান্সার কোষগুলির বিপাকীয় রাষ্ট্রের দ্রুত এবং গভীর পরিবর্তন ঘটায়। 1 এইচ এর পরে, বেশিরভাগ বিপাক তীব্রতা হ্রাস দেখিয়েছিল, গ্লাইকোলাইসিসের দ্রুত দমন এবং ফলস্বরূপ ক্যান্সার কোষগুলিতে সাধারণ বিপাকীয় যন্ত্রপাতি বজায় রাখার জন্য প্রয়োজনীয় শক্তি হ্রাসের সাথে সামঞ্জস্য রেখে consistent স্থানান্তরটি নাটকীয় ছিল এবং এটি প্রশংসনীয় যে এইচএএমএলইটি-তে দ্রুত কোষের মৃত্যুর প্রতিক্রিয়া হতে পারে, এই প্রভাব থেকে, শক্তি এবং বিপাকীয় ক্রিয়াকলাপ থেকে বঞ্চিত কোষগুলি কোষের মৃত্যুর মধ্য দিয়ে পরিচিত (ক্রোয়েমার এবং পোয়েসিগুর, ২০০৮) হিসাবে পরিচিত। এমএস / এমএস বিশ্লেষণগুলি এস- এডেনোসিল-এল-হোমসিসটাইন, ক্রিয়েটাইন, ফসফোক্রেটিন, টাউরিন এবং গ্লুটাথিয়ন ডিসলফাইড সহ কমে যাওয়া বিপাকক্রমে চিহ্নিত করেছে, যা অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের বিরুদ্ধে প্রতিরক্ষার মৌলিক মধ্যস্থতা (বেলেন্ডেরান এট আল।, 2004)। লক্ষ্যযুক্ত জিসি-এমএস প্রোফাইলিং 15 মিনিটের পরে ইতিমধ্যে হ্যামলেট-চিকিত্সাযুক্ত টিউমার কোষগুলিতে প্রচুর পরিমাণে ওলিক অ্যাসিড চিহ্নিত করেছে, যা ইঙ্গিত করে যে অতিরিক্ত পরিমাণে ফ্যাটি অ্যাসিড এবং ফ্যাটি অ্যাসিড বিপাকীয় যন্ত্রটির স্যাচুরেশন হ্যামলেটের প্রথম, দ্রুত প্রতিক্রিয়ার জন্য দায়ী হতে পারে। আমরা পরবর্তী সময় পয়েন্টগুলিতে গুরুত্বপূর্ণ গ্লুটাথিয়নের মধ্যস্থতাকারীর অবসন্নতা দেখতে পেতাম। অ্যান্টি-অক্সিডেন্ট পথগুলিতে p38 অ্যাক্টিভেশনের সাথে বর্ধিত ক্রিয়াকলাপ ইঙ্গিত দিতে পারে যে প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি হ্যামলেট প্রেরিত কোষের মৃত্যুর জন্য গুরুত্বপূর্ণ।

ক্যান্সার কোষগুলিতে বিপাকীয় পরিবর্তনের জন্য আগ্রহ যেমন গ্লাইকোলাইসিসের তাদের উচ্চ হারগুলি আবিষ্কারের মাধ্যমে পুনরায় জাগ্রত হয় যে সুপরিচিত অনকোজেনগুলির পরিবর্তনগুলি ক্যান্সার কোষ বিপাক এবং কোষের বিপাক অধ্যয়নের জন্য নতুন প্রযুক্তির আবির্ভাবকে প্রভাবিত করে। স্পষ্টতই, বিপাকীয় পথগুলি এমন পথগুলির সাথে অত্যন্ত আন্তঃসংযোগযুক্ত যা ক্যান্সারের ধ্রুপদী বৈশিষ্ট্যগুলি নিয়ন্ত্রণ করে, যেমন অনিয়ন্ত্রিত বিস্তার এবং কোষের মৃত্যুর প্রতিরোধের মতো। সুতরাং, গ্লাইকোলাইসিস প্রতিরোধ একটি গুরুত্বপূর্ণ নতুন থেরাপিউটিক লক্ষ্য হয়ে উঠছে। গ্লুকোজ অ্যানালগ 2-ডিওক্সাইগ্লুকোজকে ভিট্রোতে ক্যান্সার কোষের বেশ কয়েকটি লাইন মেরে ফেলা হয়েছে, নগ্ন ইঁদুরের অগ্ন্যাশয় ক্যান্সার কোষের বৃদ্ধি রোধ করতে এবং ডেথ রিসেপ্টর লিগান্ডস, রেডিয়েশন এবং সাইটোঅক্সিক ড্রাগগুলির প্রভাব বাড়ানোর জন্য (কোলেম্যান এট আল।, ২০০ 2008) ; হার্নালুন্ড এট।, ২০০৮)। বর্তমানে, 2-ডিওক্সাইগ্লুকোজ একক এজেন্ট হিসাবে বা সংশ্লেষ থেরাপিতে ক্লিনিকাল ট্রায়ালগুলিতে রয়েছে। তদ্ব্যতীত, 3-ব্রোমোপাইরুভেট ইঁদুরগুলিতে আপাত বিরূপ প্রভাব ছাড়াই উন্নত ক্যান্সারগুলি নির্মূল করেছিল (কো এট আল।, 2004)। হ্যামলেট একটি নতুন থেরাপিউটিক বিকল্প উপস্থাপন করে, সি-মাইক- এবং রাস-নির্ভর নির্ভর রূপান্তর দ্বারা নিয়ন্ত্রিত গ্লাইকোলাইসিস এবং অন্যান্য সেলুলার পাথগুলিকে বাধা দিয়ে আরও বিস্তৃতভাবে অভিনয় করে। স্বাস্থ্যকর, পার্থক্যযুক্ত কোষগুলিতে হ্যামলেট সংবেদনশীলতার অভাব এবং বিভিন্ন টিউমার মডেলগুলিতে ভিভো বিষের অভাব এছাড়াও হ্যামলেটের ক্লিনিকাল সম্ভাবনাকে বাড়িয়ে তোলে।

সম্পূরক তথ্য

পিডিএফ ফাইল

  1. 1।

    পরিপূরক চিত্রগুলি এস 1 – এস 5

শব্দ নথি

  1. 1।

    পরিপূরক পরিসংখ্যান কিংবদন্তি

  2. 2।

    পরিপূরক সারণী কিংবদন্তী

এক্সেল ফাইল

  1. 1।

    পরিপূরক সারণী এস 1

  2. 2।

    পরিপূরক সারণী এস 2

    সম্পূরক তথ্য অনকোজিন ওয়েবসাইটে কাগজের সাথে রয়েছে (//www.nature.com/onc)